馬茹菲，馬玉帛，佟世生，劉 萍

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京100083；2.東北師范大學(xué)附屬中學(xué)國際部，吉林長春130377；3.北京城市學(xué)院生物醫(yī)藥學(xué)部，北京100094）

白酒是我國傳統(tǒng)的蒸餾酒，在中國文化和人們的日常生活中都扮演著重要的角色。白酒的流行一部分因素是由于其口味的多樣性，根據(jù)香型可以將其分為濃香型、清香型和醬香型等[1]。白酒是以谷物（主要是高粱）為原料，通過發(fā)酵、蒸餾和貯存（陳釀）而制成。大曲是一種重要的糖化發(fā)酵劑，用于生產(chǎn)白酒和醋，對于產(chǎn)品風(fēng)味的形成具有重要的影響[2-3]。大曲本身也是通過發(fā)酵而制成，大約需要1個(gè)月的時(shí)間，并進(jìn)行6個(gè)月的成熟儲(chǔ)存期[4]。

清香型白酒是我國最古老的酒種之一，具有清香純正、醇甜柔和、自然協(xié)調(diào)、余味爽凈的特點(diǎn)[5]。清香純正即主體香乙酸乙酯與乳酸乙酯搭配協(xié)調(diào)，琥珀酸的含量也很高，無雜味，也可稱酯香勻稱，干凈利落[6]。清香型大曲系用大麥、豌豆為原料制成，為我國古老曲種之一。制曲的目的主要是利用多種酶類的生化性能，使它變成我國獨(dú)特形式的糖化劑和發(fā)酵劑。質(zhì)量上乘的大曲是生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)清香型白酒的關(guān)鍵所在，是最終形成白酒獨(dú)特風(fēng)格的決定因素。

“曲是酒之骨，好曲出好酒”，因此大曲在白酒釀造過程中起著非常重要的作用[7-8]。但是由于制曲過程中環(huán)境的高度開放性和不確定性等諸多不可控因素，使得酒曲品質(zhì)缺乏統(tǒng)一性和穩(wěn)定性。傳統(tǒng)大曲的品質(zhì)評定只局限于感官層面，但隨著監(jiān)測手段的發(fā)展和科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，更多的理化指標(biāo)和生化參數(shù)參與到了大曲質(zhì)量的評定之中?；诖朔N情況，本研究以不同來源的清香型白酒大曲作為研究對象，分別從感官評價(jià)、理化參數(shù)、生化指標(biāo)和揮發(fā)性成分等角度分別對幾種樣品大曲進(jìn)行品質(zhì)分析，為大曲評定標(biāo)準(zhǔn)的統(tǒng)一化和清香型白酒生產(chǎn)發(fā)酵劑的優(yōu)化提供一定的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

6種不同來源的清香型大曲樣品分別取自山西、江蘇、四川和山東的當(dāng)?shù)鼐茝S，大曲均為紅心、清茬、后火3種大曲混合而成。將采集得到的大曲粉碎后過40目篩，采用四分法混合均勻后于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?。樣品信息見?。

表1 各樣品名稱及簡稱

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大曲的感官評定

大曲的感官品質(zhì)可以依據(jù)外觀、斷面和香味等感官指標(biāo)來初步描述。香味：將曲塊折斷后用鼻子嗅，是否香味撲鼻，無酸臭等其他異味。外觀：是否灰白一片，無異色，穿衣均勻，無裂口，光滑。斷面：是否灰白色一片，有較密集的菌絲生長，斷面層次是否均勻等。

1.2.2 大曲中微生物分析

準(zhǔn)確稱取10 g大曲粉加入裝有90 mL無菌生理鹽水的三角瓶中，搖床充分振蕩30 min，取1 mL加入到裝有9 mL無菌生理鹽水的試管中，得到10-2稀釋液，依次操作得到10-3、10-4和10-5稀釋液。吸取0.1 mL稀釋液加入培養(yǎng)皿中，倒入溫度適中的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基和馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基，搖晃混勻，待凝固后倒置，前兩個(gè)放入35℃培養(yǎng)箱中，后兩個(gè)放入30℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)1～2 d后，分別對細(xì)菌、芽孢桿菌、酵母菌和霉菌進(jìn)行計(jì)數(shù)[9]。

1.2.3 大曲中理化和生化指標(biāo)分析

大曲中的水分、淀粉、酸度、發(fā)酵力、液化力、糖化力和酯化力的測定參照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《釀酒大曲通用分析方法》[10]。標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，水分含量以百分比表示；淀粉含量為每100 g大曲中含有淀粉的質(zhì)量，單位為g/100 g；酸度為10 g絕干大曲消耗0.1 mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的毫摩爾數(shù)，單位為mmol/10 g。發(fā)酵力表示為在30℃下，72 h內(nèi)0.5 g大曲利用可發(fā)酵糖類所產(chǎn)生的二氧化碳克數(shù)為一個(gè)發(fā)酵力單位，以（g/0.5 g·72 h）表示；液化酶活力表示為在35℃、pH4.6條件下，1 g絕干曲1 h能液化淀粉的克數(shù)為一個(gè)液化力單位，符號為U，以U/g表示；糖化力表示在35℃、pH4.6條件下，1 g絕干曲1 h轉(zhuǎn)化可溶性淀粉生成葡萄糖的毫克數(shù)為一個(gè)糖化力單位，符號為U，以U/g表示；酯化酶活力為每50 g大曲在35℃下，經(jīng)過7 d催化己酸和乙醇合成己酸乙酯的毫克數(shù)為一個(gè)酯化力單位，符號為U，以U/50 g表示。

蛋白酶活力測定方法參照國家標(biāo)準(zhǔn)SB/T 10317—1999。酶活定義：在40℃條件下，1 g大曲每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸為1個(gè)蛋白酶活力單位，以U/g表示。

纖維素酶測定方法采用DNS法[11]，酶活定義：在50℃，自然pH值條件下，1 g大曲每分鐘催化纖維素水解生成1 μg葡萄糖的酶量為一個(gè)酶活力單位，以U/g表示。

1.2.4 大曲的揮發(fā)性成分分析

參考Ding等[12]使用的方法：準(zhǔn)確稱取1.00 g大曲樣品放入頂空瓶中，再加入20 μL 2-辛醇甲醇溶液 (0.82 g/L)，蓋上瓶蓋。取 50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，在磁力攪拌器上插入加有20 μL 2-辛醇甲醇溶液和1.00 g大曲的頂空瓶，萃取溫度60℃，頂空吸附45 min，再插入溫度為250℃的氣質(zhì)聯(lián)用儀上解吸5 min后進(jìn)行檢測。

氣相色譜條件：氦氣作為載氣，流速控制為1 mL/min；升溫程序：起始溫度40℃，維持5 min，以5℃/min升至220℃，維持5 min；氣化室溫度為250 ℃；分流比為10∶1。

質(zhì)譜條件：選擇電子轟擊電離離子源（EI），電子能為70 eV，離子源溫度為230℃，質(zhì)量范圍控制在40～400 u。

利用保留系數(shù)對揮發(fā)性組分進(jìn)行定性分析，并計(jì)算各樣品中各類揮發(fā)性組分的相對豐度。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析

所有樣品重復(fù)做3次平行，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。使用方差分析(ANOVA)對不同樣品中微生物數(shù)量和理化生化指標(biāo)等進(jìn)行顯著性分析（P＜0.05）。所有統(tǒng)計(jì)分析均使用SPSS 20.0和Excel 2013。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同大曲感官特征的評定

對于大曲的判定標(biāo)準(zhǔn)，在外觀方面主要表現(xiàn)為外觀、斷面和香味等指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)選擇了6種不同來源的清香型大曲樣品，對其感官特征進(jìn)行分析比較，結(jié)果見表2。

從外觀角度比較，F(xiàn)J、TY大曲樣品色澤單一無雜色，菌絲均勻整齊，無裂口；從斷面角度比較，F(xiàn)J、TY和XY大曲樣品無論是色澤還是泡氣程度等性狀都比其他樣品好；FJ、TY、XY大曲樣品在香氣上也表現(xiàn)出濃郁且無雜味的良好特征，而JS、SC、SD這3種大曲的曲香表現(xiàn)為淡薄且夾雜輕微異味。

2.2 不同大曲主要微生物的種類和數(shù)量分析

不同清香型大曲樣品的細(xì)菌、芽孢桿菌、霉菌和酵母菌數(shù)量見表3。

表3反映了大曲中細(xì)菌、芽孢桿菌、霉菌和酵母菌的數(shù)量與感官評定之間的關(guān)系。TY大曲樣品中細(xì)菌和芽孢桿菌的數(shù)量相比于其他樣品均較高，其中芽孢桿菌的數(shù)量分別是來自相同區(qū)域的FJ和XY數(shù)量的3倍左右，而芽孢桿菌與大曲的曲香有一定的相關(guān)性。表中FJ、TY、XY 3種樣品相比于其他樣品在霉菌數(shù)量方面差異顯著，高出近一個(gè)數(shù)量級。感官評價(jià)的結(jié)果顯示，F(xiàn)J、TY、XY 3種大曲的“穿衣”均優(yōu)于其他大曲，大曲的“穿衣”一般是微生物尤其是霉菌生長好壞的外在表現(xiàn)特征，由于霉菌在生長繁殖過程中可產(chǎn)生糖化酶、液化酶、蛋白酶、纖維素酶等多種酶類，所以霉菌的生長繁殖狀況對各種酶活力有很大的影響，即大曲穿衣是評定大曲質(zhì)量的一個(gè)重要標(biāo)準(zhǔn)[13]。

2.3 不同大曲理化成分分析

衡量大曲的理化性質(zhì)，可以用水分、淀粉含量、酸度以及蛋白質(zhì)含量等理化成分指標(biāo)進(jìn)行比較，分別測定6種清香型大曲的相關(guān)指標(biāo)，結(jié)果見表4。

表2 對不同清香型大曲的外觀、斷面和香味等感官特征的比較

表3 6種清香型白酒大曲中微生物數(shù)量比較(log cfu/g)(n=3)

成品大曲的水分表征了大曲所含水分的多少，隨貯藏時(shí)間的延長，大曲的水分含量逐漸減少，表明發(fā)酵產(chǎn)生的游離水越多，揮發(fā)能力強(qiáng)，大曲的成熟度更佳。根據(jù)制曲車間成品大曲出廠檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)規(guī)定，大曲中的水分含量不能超過總質(zhì)量的13%，根據(jù)表4結(jié)果顯示，幾種樣品大曲水分含量均合格。

在制曲過程中，曲塊發(fā)生了復(fù)雜的發(fā)酵過程，而大曲的酸度正是由曲塊中的蛋白質(zhì)、脂肪等產(chǎn)酸微生物進(jìn)行有機(jī)代謝產(chǎn)生，大曲酸度是反映大曲微生物的新陳代謝和評定大曲質(zhì)量的重要指標(biāo)。表3反映出TY大曲樣品酸度明顯高于其他樣品，其余大曲酸度含量也有所差異，但與白鋼等[14]的研究結(jié)果基本相同，其揭示出不同大曲樣品中產(chǎn)酸微生物的數(shù)量有較大差異[15]。分析表4可知，SD、JS大曲樣品淀粉含量相對較高，大曲中淀粉含量與其糖化酶和液化酶活性關(guān)系密切，在制曲過程中，制曲微生物產(chǎn)生的糖化酶和液化酶活性越高，顯著地表現(xiàn)出對淀粉原料的降解和消耗。在蛋白含量方面幾種大曲樣品同樣表現(xiàn)出明顯的差異，其中SD樣品中蛋白質(zhì)含量高達(dá)24.26 mg/g，而SC樣品中蛋白質(zhì)含量只有8.76 mg/g。

2.4 不同大曲發(fā)酵力和酶活力比較

大曲的發(fā)酵力和酶活力是反映大曲品質(zhì)的重要生化指標(biāo)，比較不同大曲樣品的發(fā)酵力以及液化酶、糖化酶、蛋白酶、纖維素酶和酯化酶等5種酶活力的情況，結(jié)果見表5。

二氧化碳的失重表征了大曲的發(fā)酵力，6種大曲的發(fā)酵力情況見表5。由表5可看出，不同清香型大曲樣品的發(fā)酵能力不同。其中XY、TY、JS和FJ樣品發(fā)酵力均較強(qiáng)，表明其中微生物的生長代謝和繁殖的速度較快。

大曲中的酶系是分解大曲中淀粉和蛋白質(zhì)等原料的動(dòng)力，分解產(chǎn)物為微生物的新陳代謝提供物質(zhì)基礎(chǔ)。表5顯示，幾種大曲中液化酶活力較小，均保持在0.5～1.1 U/g的范圍內(nèi)。大曲中微生物尤其是霉菌的生長繁殖狀況與液化酶活力有緊密的聯(lián)系，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，F(xiàn)J、TY大曲樣品液化酶活力相對較高。糖化酶活力差異較為顯著，高低差異可達(dá)4倍，最高者為XY大曲樣品，為502.1 U/g，最低者SC大曲樣品同時(shí)也是液化酶活力最低。6種大曲的蛋白酶活力也有明顯差異，其中XY、FJ大曲樣品中蛋白酶活力大于100 U/g。曲霉、毛霉、根霉和芽孢桿菌廣泛存在于大曲中，這些產(chǎn)蛋白酶微生物的生長繁殖狀況是大曲中蛋白酶活力高低的關(guān)鍵因素[16]。蛋白酶可分解蛋白質(zhì)生成氨基酸，氨基酸能夠參與美拉德反應(yīng)生成風(fēng)味物質(zhì)，有利于促進(jìn)大曲風(fēng)味前體物質(zhì)的形成；蛋白酶活力越高，曲香表現(xiàn)越濃郁，這與大曲感官評定中的香味判定標(biāo)準(zhǔn)相一致。FJ、TY大曲樣品的纖維素酶活力高于其他樣品，纖維素酶在白酒釀造中起著重要的作用，它能夠?qū)⒗w維素類原料降解為微生物可利用的糖類，提高對原料的利用率。TY大曲樣品中酯化酶活力明顯較高，大曲中的酯類化合物與大曲風(fēng)味的形成密切相關(guān)，大曲的酯化酶活力是催化產(chǎn)生這些酯類化合物的動(dòng)力，酯化酶活力越高則大曲在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酯類化合物越多，這有利于促進(jìn)白酒風(fēng)味的形成[17]。

表4 幾種清香型白酒大曲理化成分

表5 不同清香型大曲發(fā)酵力和酶活力比較

2.5 不同大曲揮發(fā)性成分分析

6種不同的大曲樣品共檢出了78種揮發(fā)性組分，根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，分為醇類（9）、酸類（3）、酯類（17種）、醛類（4）、酮類（8）、烷類（19）、其他類（18）組分。各樣品中揮發(fā)性組分種類及所占比例分別見圖1和圖2。

圖1 各樣品中揮發(fā)性物質(zhì)的種類

圖2 各類揮發(fā)性組分在各樣品中所占的比例

從圖1和圖2可以看出，不同清香型大曲樣品中揮發(fā)性成分的種類和相對豐度有所差異，其中醇類、酯類、酮類、醛類和烷類為含量相對較高的化合物?；衔锓N類的數(shù)量一定程度上體現(xiàn)了大曲樣品中微生物的代謝情況。在FJ、TY、XY、JS、SC、SD大曲樣品中分別檢測到31種、34種、41種、20種、25種、24種物質(zhì)，說明FJ、TY、XY大曲樣品中揮發(fā)性成分更復(fù)雜。其中FJ樣品中檢測到最多種類的醇類和酮類，XY樣品中檢測到最多種類的酯類和烷類。綜合檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)J、TY、XY樣品揮發(fā)性成分豐富，這與感官評價(jià)中曲香較濃郁的結(jié)論相一致。

從化合物種類角度分析，較高含量的醇類是大曲微生物代謝的前體物質(zhì)，醇類是形成酯類的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，而酯類和芳香族化合物又構(gòu)成了大曲的獨(dú)特曲香。醇類主要由酵母在有氧條件下利用糖發(fā)酵生成，而在厭氧條件下通過氨基酸生成，或者由酵母利用相應(yīng)的醛通過化學(xué)還原反應(yīng)形成[18]。高級醇含量可以在一定程度上反映大曲中酵母菌的代謝情況。

酯類是揮發(fā)性成分中較為重要的呈香物質(zhì)，其中大曲中的部分酯類物質(zhì)也會(huì)進(jìn)入到大曲酒中形成酒中獨(dú)特的風(fēng)格。其中白酒中的酯類物質(zhì)主要包括兩大類，分別是乙酸酯和乙醇酯。乙醇酯是由乙醇和其他有機(jī)酸在相應(yīng)酶的催化下脫水縮合而成；而乙酸酯則是由除乙醇外的醇類物質(zhì)在催化條件下合成。在樣品大曲中檢測到多種酯類，酯類化合物一般具有水果等令人愉悅的芬芳香氣，對白酒獨(dú)特風(fēng)味和品格的形成具有重要作用。

脂肪酸類物質(zhì)的來源既包括產(chǎn)酸細(xì)菌的代謝也包括真菌的代謝，脂肪酸類物質(zhì)同樣是形成酯類的前體物質(zhì)，同時(shí)在白酒中產(chǎn)生特定的香味或酸腐味，很大程度上影響著白酒的口感。大曲中醛酮類物質(zhì)可由微生物降解大曲原料中的淀粉類物質(zhì)，在糖酵解過程中尤其是在酵母的作用下產(chǎn)生。它們與大曲中的酯類物質(zhì)共同構(gòu)成了大曲的獨(dú)特曲香，并且酮類和醛類也會(huì)通過發(fā)酵進(jìn)入大曲酒中，作為微生物代謝的前體物質(zhì)參與酒香的形成。

3 結(jié)論

本研究從感官特征、微生物指標(biāo)、理化生化指標(biāo)和揮發(fā)性成分等方面出發(fā)，選取不同地區(qū)的6種清香型大曲進(jìn)行了品質(zhì)分析。結(jié)果表明，在感官特征（外觀、斷面、香味）方面，F(xiàn)J、TY、XY這3種清香型大曲樣品菌絲均勻，色澤灰白良好，泡氣整齊，曲香濃郁，其他3種樣品感官評價(jià)較差。在微生物方面，不同樣品中細(xì)菌、芽孢桿菌、霉菌和酵母菌的數(shù)量差異明顯，其中FJ、TY、XY樣品大曲中微生物數(shù)量較多，微生物尤其是霉菌數(shù)量的不同與大曲的感官特征關(guān)系密切，同時(shí)也是其代謝產(chǎn)生酶系活力差異的重要原因；在理化指標(biāo)方面，大曲樣品水分含量適宜，F(xiàn)J、TY、SC大曲樣品自身淀粉的消耗較多，同時(shí)TY大曲酸度顯著高于其他樣品；對生化酶活性分析結(jié)果表明，F(xiàn)J、TY、XY大曲有較好的發(fā)酵能力，液化力、糖化力、酯化能力都較強(qiáng)；在揮發(fā)性成分方面，醇類、酯類、酮類、醛類和烷類為大曲樣品中含量相對較高的化合物，其中在FJ、TY、XY樣品中檢測到較多的揮發(fā)性成分，這與感官評價(jià)中曲香較濃郁的結(jié)論相一致。要建立較準(zhǔn)確的大曲質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，需綜合感官指標(biāo)、微生物指標(biāo)以及理化生化指標(biāo)等多個(gè)參數(shù)共同進(jìn)行評定，還需要進(jìn)一步研究各個(gè)指標(biāo)對釀酒品質(zhì)的影響程度，重新對其進(jìn)行權(quán)衡，制定出行業(yè)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，從而幫助推動(dòng)制曲專業(yè)化的進(jìn)一步發(fā)展。