黃仕千 農(nóng)揚(yáng) 楊昭遠(yuǎn) 張?chǎng)?俸祥仁 劉偉

（1，廣西百色市田陽(yáng)區(qū)那滿(mǎn)鎮(zhèn)水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)站 533600；2，廣西壯族自治區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所 530001；3，廣西南寧市江南區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所 530000；4，廣西南寧市動(dòng)物園 530000；5，廣西南寧強(qiáng)微農(nóng)牧科技有限公司 530001；6，廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所 530001）

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS） 由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV） 引起的一種急性接觸性傳染病，主要引起妊娠母豬的繁殖障礙以及仔豬的呼吸道癥狀[1,2]。豬傳染性胃腸炎是由冠狀病毒科冠狀病毒屬的豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV） 引起的一種急性、高度接觸性腸道傳染病，以嘔吐、嚴(yán)重腹瀉、脫水、2 周齡內(nèi)仔豬高死亡率為特征，通常死于脫水和電解質(zhì)代謝紊亂[3]。目前，豬繁殖與呼吸綜合征和豬傳染性胃腸炎兩種病毒性疾病在我國(guó)廣泛存在，給養(yǎng)殖業(yè)造成了極大的危害。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)復(fù)方金連菊中藥溶液體外抑制PRRSV、TGEV 的活性進(jìn)行初步研究，旨在為臨床上控制兩種疫病提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)藥物

復(fù)方金連菊中藥溶液由廣西南寧強(qiáng)微農(nóng)牧科技有限公司與廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所聯(lián)合研制[4,5]，規(guī)格： 1g 原藥材/ml。

1.1.2 毒株、細(xì)胞

PRRSV，Marc-145 傳代細(xì)胞，PK-15 傳代細(xì)胞，TGEV 均為廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所病毒研究室提供。

1.1.3 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基、小牛血清、胰蛋白酶（0.25%）、NaHCO3、雙抗（青霉素80 萬(wàn)單位、鏈霉素80 單位）

1.2 方法

（1） PRRSV、TGEV 病毒毒力測(cè)定（TCID50）。按殷震[6]方法、馮曉巍[3]方法將Marc-145 傳代細(xì)胞進(jìn)行消化傳代，細(xì)胞數(shù)調(diào)整至2×105個(gè)/ml，加到96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，100ul/孔，置于5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，接種用DMEM 細(xì)胞維持液稀釋的濃度分別為10-1～10-12 的PRRSV病毒液，100ul/孔，每個(gè)稀釋度接種5 孔，5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96h，每天觀察CPE 產(chǎn)生情況。

將PK-15 傳代細(xì)胞同上述方法進(jìn)行，待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，接種用1640 細(xì)胞維持液稀釋的濃度分別為10-1～10-12的PRRSV病毒液。按Reed-Muench 公式計(jì)算TCID50[7-9]。

（2） 對(duì)Marc-145 傳代細(xì)胞，PK-15 傳代細(xì)胞安全濃度的測(cè)定。按馮曉巍[3]方法取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞株，細(xì)胞數(shù)調(diào)整為2×105個(gè)/ml，加入96 孔板中，100ul/孔。置于5%CO2培養(yǎng)箱中37℃，待貼壁長(zhǎng)成單層后將藥液用2%DMEM 細(xì)胞維持液連續(xù)的倍比稀釋后，加到已長(zhǎng)成單層的96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，藥液濃度見(jiàn)表1。并設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照組，每個(gè)濃度重復(fù)5 孔，置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察CPE 情況，96h 后棄培養(yǎng)液上清部分，每孔加入含5mg/ml 噻唑藍(lán)（MTT） 的2%DMEM 細(xì)胞維持液30ul，繼續(xù)培養(yǎng)4h 后，棄MTT 上清，每孔加溶解液二甲基亞砜（DMSO） 100ul，室溫震蕩10min 使結(jié)晶物溶解，然后用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)儀在570nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。

對(duì)PRRSV、TGEV 的阻斷作用測(cè)定。按馮曉巍[3]方法將藥液用2%DMEM （TGEV 用10%和2%1640） 細(xì)胞維持液作連續(xù)的倍比稀釋的藥液濃度，分別加到長(zhǎng)滿(mǎn)單層Marc-145 傳代細(xì)胞的96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，100ul/孔，每個(gè)稀釋度重復(fù)5 孔。37℃作用4h，棄去藥液，每個(gè)孔加入100TCID50病毒液，100ul/孔，另設(shè)細(xì)胞對(duì)照組和病毒對(duì)照組。5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)，每天觀察CPE，當(dāng)病毒CPE 達(dá)到“+++或++++” 時(shí)，按MTT 吸收法用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在570nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度值（OD570）。

對(duì)PRRSV、TGEV 的抑制作用測(cè)定。按馮曉巍[3]方法將100TCID50病毒液接種至長(zhǎng)成單層Marc-145 傳代細(xì)胞的96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，100ul/孔，37℃吸附2h，棄去病毒液，加入2%DMEM （TGEV 用10%和2%1640） 細(xì)胞維持液作連續(xù)的倍比稀釋的藥液濃度，100ul/孔，每個(gè)稀釋度重復(fù)5 孔，另設(shè)細(xì)胞對(duì)照和病毒對(duì)照。5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)，每天觀察CPE，當(dāng)病毒CPE 達(dá)到“+++或++++” 時(shí)，按MTT 吸收法用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在570nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度值。

表1 中藥提取物抑菌濃度與對(duì)應(yīng)的藥物稀釋倍數(shù)關(guān)系

對(duì)PRRSV、TGEV 的直接殺滅作用測(cè)定。按馮曉巍[3]方法將各個(gè)稀釋度的藥液分別與等體積100TCID50病毒液混合，37℃作用2h，加到長(zhǎng)成單層Marc-145 的96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，100ul/孔，每個(gè)稀釋度重復(fù)5 孔，另設(shè)細(xì)胞對(duì)照和病毒對(duì)照。5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)，每天觀察CPE，當(dāng)病毒CPE 達(dá)到“+++或++++” 時(shí)，按MTT 吸收法用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在570nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度值。

1.3 藥物對(duì)抗病毒感染細(xì)胞的指標(biāo)計(jì)算

細(xì)胞存活率（%）=藥物組OD570/正常細(xì)胞組OD570×100

抑制率（%）=（藥物組OD570-病毒對(duì)照組OD570）/病毒對(duì)照組OD570×100

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2007 進(jìn)行整理，用DPS 進(jìn)行單因素方差分析，并以Duncan's 法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 PRRSV、TGEV 病毒毒力測(cè)定（TCID50）

經(jīng)實(shí)驗(yàn)測(cè)得PRRSV 的病毒毒力（TCID50） 為10.05.5/0.1ml，TGEV 病毒毒力為10.05.25/0.1ml。以下病毒接種量均為100TCID50。

2.2 復(fù)方金連菊中藥制劑對(duì)Marc-145 傳代細(xì)胞，PK-15 傳代細(xì)胞的安全濃度0D570 值

由表2 可知，根據(jù)MTT 法測(cè)得復(fù)方金連菊中藥的藥液濃度為62.5mg/ml 時(shí)與正常細(xì)胞對(duì)照組OD570值相近，且相比較差異不顯著（P＞0.05）。復(fù)方金連菊中藥的藥液濃度為31.25mg/ml、15.625mg/ml、7.8125mg/ml 和3.90625mg/ml 時(shí)OD570值與正常細(xì)胞對(duì)照組相近，且相比較差異不顯著（P＞0.05）。比較復(fù)方金連菊中藥制劑對(duì)Marc-145 傳代細(xì)胞和PK-15 傳代細(xì)胞的OD570值與正常細(xì)胞對(duì)照組最相近者為最大安全濃度即62.5mg/ml、31.25mg/ml。

2.3 復(fù)方金連菊中藥制劑對(duì)PRRSV、TGEV 感染細(xì)胞的阻斷作用

表2 復(fù)方中草藥制劑對(duì)Marc-145 細(xì)胞、PK15 細(xì)胞的安全濃度

由表3 可知，復(fù)方金連菊中藥制劑的藥液濃度為500、250、125、62.5、31.25、15.625 和7.8125mg/ml 各孔吸光度值（OD570） 與正常細(xì)胞對(duì)照組吸光度值（OD570）、病毒對(duì)照組吸光度值（OD570） 相比較差異極顯著（P＜0.01）；說(shuō)明藥液濃度為500mg/ml～7.8125mg/ml 對(duì)PRRSV、TGEV 感染細(xì)胞的阻斷作用顯著。

藥液濃度為3.90625mg/ml 的吸光度值（OD570） 與正常細(xì)胞對(duì)照組相比較差異極顯著（P＜0.01），與病毒對(duì)照組相比較差異不顯著（P＞0.05）；說(shuō)明藥液濃度為3.90625mg/ml 對(duì)PRRSV、TGEV 感染細(xì)胞的阻斷作用不顯著。

由表4 可知，復(fù)方金連菊中藥制劑的藥液濃度為500、250、125、62.5、31.25 和15.625mg/ml 各孔吸光度值（OD570）與正常細(xì)胞對(duì)照組吸光度值（OD570）、病毒對(duì)照組吸光度值（OD570） 相比較差異極顯著（P＜0.01）；說(shuō)明藥液濃度為500～15.625mg/ml 對(duì)PRRSV、TGEV 感染細(xì)胞的阻斷作用顯著。藥液濃度為7.8125 和3.90625mg/ml 的吸光度值（OD570） 與正常細(xì)胞對(duì)照組相比較差異極顯著（P＜0.01），與病毒對(duì)照組相比較差異不顯著（P＞0.05），說(shuō)明藥液濃度為7.8125 和3.90625mg/ml對(duì)PRRSV、TGEV 感染細(xì)胞的阻斷作用不顯著。

2.4 復(fù)方金連菊中藥制劑對(duì)PRRSV、TGEV 增殖的抑制作用

由表3 可知，復(fù)方金連菊中藥制劑溶液濃度為500、250、125、62.5、31.25 和15.625mg/ml 對(duì)PRRSV 在Marc-145 傳代細(xì)胞上的增殖具有極顯著的抑制作用（P＜0.01），藥液濃度為3.90625mg/ml 對(duì)PRRSV 在Marc-145 傳代細(xì)胞上的增殖具有顯著的抑制作用（P＜0.05）。

由表4 可知，復(fù)方金連菊中藥制劑溶液濃度為500、250、125 和62.5mg/ml 對(duì)TGEV 在PK-15 傳代細(xì)胞上的增殖具有極顯著的抑制作用 （P＜0.01）；藥液濃度為31.25、15.625、7.8125 和3.90625mg/ml TGEV 在PK-15 傳代細(xì)胞上的增殖具有顯著的抑制作用（P＜0.05）。

表3 復(fù)方中草藥制劑對(duì)PRRSV 的體外作用

表4 復(fù)方中草藥制劑對(duì)TGEV 的體外作用

2.5 復(fù)方金連菊中藥制劑對(duì)PRRSV、TGEV 的直接殺滅作用

由表3 可知，藥液濃度在500～3.90625mg/ml 范圍內(nèi)對(duì)PRRSV 具有極顯著的直接殺滅作用（P＜0.01）。

由表4 可知，藥液濃度在500～62.5mg/ml 范圍內(nèi)對(duì)TGEV具有極顯著的直接殺滅作用（P＜0.01）；藥液濃度在31.25～3.90625mg/ml 范圍內(nèi)能夠影響TGEV 對(duì)細(xì)胞的作用，但效果不明顯（P＞0.05）。

3 結(jié)論與討論

利用合適的病毒-細(xì)胞培養(yǎng)體系，采用MTT 法考察測(cè)試藥物對(duì)病毒增殖的影響，是常用體外篩選抗病毒藥物的手段之一。本試驗(yàn)結(jié)果為復(fù)方金連菊中藥制劑體外抗PRRSV、TGEV活性提供了有力證據(jù)。試驗(yàn)所用細(xì)胞均為8～14 代的細(xì)胞，病毒是在細(xì)胞中增殖的第二代病毒，以避免細(xì)胞和病毒的差異對(duì)結(jié)果的影響。

藥物抗病毒的作用機(jī)理，一般認(rèn)為是對(duì)途經(jīng)的，但主要有2 條途徑，一是直接殺滅病毒，二是抑制病毒的繁殖。本試驗(yàn)?zāi)康氖怯^察樣品能否進(jìn)入細(xì)胞或吸附細(xì)胞表面以阻止病毒的吸附和進(jìn)入。試驗(yàn)結(jié)果顯示： 復(fù)方金連菊中藥制劑溶液對(duì)Marc-145 細(xì)胞的最大濃度為62.5mg/ml，對(duì)PK15 細(xì)胞的最大濃度為31.25mg/ml，在安全濃度以下不明顯引起細(xì)胞損傷，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性作用。復(fù)方金連菊中藥制劑溶液濃度為500～7.8125mg/ml對(duì)PRRSV 感染細(xì)胞的阻斷作用極為顯著（P＜0.01），藥液濃度為3.90625mg/ml 對(duì)PRRSV 感染細(xì)胞的阻斷作用不明顯 （P＞0.05）；藥液濃度為500～15.625mg/ml 對(duì)TGEV 感染細(xì)胞的阻斷作用極為顯著 （P＜0.01），藥液濃度7.8125～3.90625mg/ml 對(duì)TGEV 感染細(xì)胞的阻斷作用不明顯（P＞0.05）；說(shuō)明藥液濃度高于15.625mg/ml 分別能對(duì)抑制PRRSV 與Marc-145 傳代細(xì)胞和TGEV 與PK-15 傳代細(xì)胞的吸附、融合，從而阻止病毒的吸附和進(jìn)入。復(fù)方金連菊中藥制劑溶液濃度在500～3.90625mg/ml 范圍內(nèi)對(duì)PRRSV 具有極顯著的直接殺滅作用（P＜0.01），藥液濃度在500～62.5mg/ml 范圍內(nèi)對(duì)TGEV 具有極顯著的直接殺滅作用（P＜0.01）。說(shuō)明復(fù)方金連菊中藥制劑具有一定的阻止病毒的吸附和進(jìn)入效果，但具體應(yīng)用尚需進(jìn)一步臨床試驗(yàn)。