胡國(guó)輝

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 藥學(xué)部，廣東 廣州 510405)

丹參為唇形科植物丹參(SalviamiltiorrhizaBge.)的干燥根和根莖，具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消癰的功效[1-3]。臨床上主要用于治療心血管疾病、肝臟及神經(jīng)系統(tǒng)疾病，丹參藥材的活性成分主要分為兩大類，脂溶性成分[4-7]和水溶性成分[8-10]，脂溶性成分主要是丹參酮型的二萜醌類化合物，是丹參活血化瘀、抗炎和抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖的主要成分，包括丹參酮IIA、丹參酮IIB、隱丹參酮、二氫丹參酮I等，其中丹參酮IIA含量是最高的，也是丹參治療冠心病的主要有效成分之一[11-12]，此外就是丹參的水溶性化學(xué)成分，主要是酚酸類化合物，包括原兒茶醛、原兒茶酸、丹參素鈉、丹酚酸A、迷迭香酸、咖啡酸等，丹參的水溶性成分與藥理活性基本相似，均具有抗心肌缺血與缺氧的作用[13-15]，2015版藥典[2]丹參藥材項(xiàng)下脂溶性成分主要是通過(guò)一測(cè)多評(píng)法測(cè)定丹參酮IIA、隱丹參酮和丹參酮I的含量及薄層鑒別法鑒別丹參酮IIA，本實(shí)驗(yàn)在前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)丹參藥材中脂溶性成分二氫丹參酮也可以同時(shí)測(cè)出，且二氫丹參酮也具有抗菌、抗氧化和擴(kuò)張冠狀血管等活性，與丹參的藥理作用一致，因此有必要對(duì)其進(jìn)行測(cè)定，故本實(shí)驗(yàn)增加丹參酮類成分的定性鑒別及含量測(cè)定，從而更加全面控制丹參藥材的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

Agilent 1260高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫儀器公司)，Agilent chemstation色譜工作站，Agilent XDB C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，硅膠GF254薄層板(10 cm×20 cm)(Merck公司)，乙腈為色譜純(美國(guó)Fisher公司)，磷酸為GR級(jí)(上海國(guó)藥化學(xué)試劑公司)；ML204T、XPE205電子分析天平(METTLER TOLEDO公司)。對(duì)照品：二氫丹參酮，批號(hào)：D101537，含量以98.0%計(jì)；丹參酮I，批號(hào)：T118876，含量以97.0%計(jì)，購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；隱丹參酮，批號(hào)：110852-200806，含量以98.7%計(jì)；丹參酮IIA，批號(hào)：110766-201520，含量以98.9%計(jì)，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。石油醚(60～90 ℃)、乙酸乙酯、環(huán)己烷等試劑均購(gòu)自上海國(guó)藥化學(xué)試劑公司，不同產(chǎn)地丹參藥材來(lái)源見附表1。

表1 丹參藥材樣品來(lái)源

2 方法與結(jié)果

2.1 四種脂溶性成分的TLC鑒別

取不同產(chǎn)地的丹參藥材粉碎，過(guò)二號(hào)篩，取粉末1 g，加乙醚10 mL，靜置1 h，然后濾過(guò)，濾液揮發(fā)溶劑至干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液，另取二氫丹參酮、丹參酮I隱丹參酮和丹參酮IIA對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL分別含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。按照薄層色譜法(通則0502)試驗(yàn)，吸取上述供試品溶液和對(duì)照品溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一高效硅膠GF254薄層板上，用石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯-環(huán)己烷(5∶3∶2)為展開劑，展開，取出，晾干，分別在日光及紫外燈(254 nm)下檢視，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)和熒光斑點(diǎn)。見圖1。

注：1.山東泰安薛家莊；2.山東臨沂麥坡村；3.山東臨沂常嶺村；4.山東濰坊臨朐縣；5.四川中江縣金錢村；6.四川廣元蒼溪縣；7.四川廣元青川縣；8.陜西商洛鎮(zhèn)安縣；9.陜西漢中西鄉(xiāng)縣；10.陜西商洛商南縣；S1 丹參酮IIA；S2丹參酮I； S3.隱丹參酮；S4.二氫丹參酮。

2.2 色譜條件

Agilent XDB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：以乙腈為流動(dòng)相A，0.03%磷酸為流動(dòng)相B，按下表2梯度洗脫；柱溫20 ℃，流速1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm；理論塔板數(shù)按丹參酮IIA峰計(jì)算應(yīng)不低于10 000。

2.3 對(duì)照品溶液制備

精密稱取二氫丹參酮對(duì)照品10.58 mg、隱丹參酮對(duì)照品12.39 mg、丹參酮I對(duì)照品6.52 mg，丹參酮IIA對(duì)照品17.26 mg置同一25 mL量瓶中，加二氯甲烷2 mL，振搖使溶解，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為6號(hào)對(duì)照品溶液；精密吸取6號(hào)對(duì)照品溶液3 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為5號(hào)對(duì)照品溶液；精密吸取5號(hào)對(duì)照品溶液3 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為4號(hào)對(duì)照品溶液；精密吸取4號(hào)對(duì)照品溶液3 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為3號(hào)對(duì)照品溶液；精密吸取3號(hào)對(duì)照品溶液，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為2號(hào)對(duì)照品溶液；精密吸取2號(hào)對(duì)照品溶液，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為1號(hào)對(duì)照品溶液。

表1 流動(dòng)相洗脫程序

2.4 供試品的制備

取山東泰安薛家莊丹參藥材粉末樣品(過(guò)三號(hào)篩)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇溶液50 mL，稱定重量，超聲處理(功率500 W，頻率53 kHz)30 min，取出放涼，再稱定重量，用75%甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液用0.45 μm濾膜濾過(guò)，即得。

注：A為混合對(duì)照品；B為供試品(從左到右四個(gè)峰依次為二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA)

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系考察 精密吸取1～6號(hào)對(duì)照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，各進(jìn)樣2次，按照預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的色譜條件(C18色譜柱，4.6 mm×250 mm，5 μm，流動(dòng)相，A為乙腈，B為0.03%磷酸，梯度洗脫，柱溫20 ℃，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm)測(cè)定峰面積，以峰面積的平均值為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量的質(zhì)量(ng)為橫坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程，結(jié)果見表2。

表2 4種丹參酮類成分的線性方程、線性范圍及相關(guān)系

2.5.2 精密度 分別精密吸取上述“2.3”項(xiàng)下的1、3、6號(hào)混合對(duì)照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按照“2.2”項(xiàng)下的色譜條件各進(jìn)樣6次，結(jié)果1號(hào)對(duì)照品中二氫丹參酮、丹參酮I、隱丹參酮和丹參酮IIA峰面積的RSD分別為0.55%、0.38%、1.22%和0.76%；3號(hào)對(duì)照品中二氫丹參酮、丹參酮I、隱丹參酮和丹參酮IIA峰面積的RSD分別為1.58%、2.02%、1.77%和1.62%；6號(hào)對(duì)照品中二氫丹參酮、丹參酮I、隱丹參酮和丹參酮IIA峰面積的RSD分別為0.47%、0.51%、0.56%和0.32%，結(jié)果表明儀器的進(jìn)樣精密度良好。

2.5.3 重復(fù)性 取山東泰安薛家莊丹參藥材粉末(過(guò)三號(hào)篩)約0.5 g，精密稱定，共6份，置具塞錐形瓶中，分別精密加入75%甲醇溶液50 mL，稱定重量，超聲處理20 min，取出放涼，再稱定重量，用75%甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液用0.45 μm濾膜濾過(guò)，即得。按照“2.2”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，結(jié)果二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA含量值的RSD分別為0.27%、0.58%、0.42%和1.03%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.4 穩(wěn)定性 取上述重復(fù)性項(xiàng)下的一份樣品，分別于0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h和24 h各進(jìn)樣1次，按照“2.2”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，結(jié)果二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA峰面積值的RSD分別為1.05%、0.92%、0.35%和1.66%，結(jié)果表明該供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.5 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取二氫丹參酮對(duì)照品6.82 mg，丹參酮I對(duì)照品8.56 mg，置同一10 mL量瓶中，加二氯甲烷1 mL使溶解，然后加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為儲(chǔ)備溶液；另精密稱取隱丹參酮對(duì)照品5.88 mg、丹參酮IIA對(duì)照品7.36 mg，置同一10 mL量瓶中，精密加入上述儲(chǔ)備溶液2 mL，加入甲醇溶解至刻度，搖勻，作為加樣用對(duì)照品溶液。另精密稱取山東泰安薛家莊丹參藥材(過(guò)3號(hào)篩)樣品0.25 g，共6份，分別置具塞錐形瓶中，每組分別精密加入上述加樣用對(duì)照品溶液各1 mL，再精密加入75%甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理30 min，取出放涼，再稱定重量，用75%甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液用0.22 μm濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液即得。按照重復(fù)性項(xiàng)下的色譜條件和對(duì)照品溶液進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表3。

表3 丹參藥材中4種丹參酮類成分的加樣回收試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

2.5.6 檢出限和定量限 按照空白溶劑實(shí)驗(yàn)分別計(jì)算3倍噪音和10倍噪音作為方法的檢出限和定量限，結(jié)果二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA的檢出限分別為0.612 μg·g-1、0.307 μg·g-1、0.528 μg·g-1和1.34 μg·g-1，定量限為2.04 μg·g-1、1.02 μg·g-1、1.76 μg·g-1和4.47 μg·g-1。

2.6 含量測(cè)定

取不同產(chǎn)地的10批次丹參藥材按照上述“2.4”方法制備，“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見表4。

表4 丹參藥材中二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA含量測(cè)定結(jié)果 (%)

3 結(jié)果與討論

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

由于不同產(chǎn)地藥材中含量差異較大，因此在標(biāo)準(zhǔn)的制備中應(yīng)充分考慮，本實(shí)驗(yàn)采用逐級(jí)稀釋法，等比數(shù)列稀釋，最大濃度與最小濃度相差411倍，這樣才能更好地適用于中藥材的含量測(cè)定，保證藥材的含量在標(biāo)曲線性范圍之內(nèi)。如果采用等差數(shù)列進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)制備，則線性范圍較窄，不能很好地保證適用于所測(cè)藥材，如果中成藥含量測(cè)定中，由于藥材的產(chǎn)地來(lái)源固定，含量相差不大，可以采用等差比例稀釋作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3.2 供試品制備的考察

本實(shí)驗(yàn)在供試品溶液制備過(guò)程中分別考察了不同溶劑(甲醇，75%甲醇、50%甲醇、甲醇)，不同提取方法(冷浸、超聲、回流)、不同超聲時(shí)間(20 min、30 min、40 min)，超聲功率(150 W、350 W、500 W)，發(fā)現(xiàn)丹參酮類化合物不穩(wěn)定，容易相互轉(zhuǎn)換，最終考察采用75%甲醇作為提取溶劑、超聲提取方法、提取30 min中功率500 W為最佳供試品制備方法，該條件下4種丹參酮脂溶性成分含量最高，因此選擇上述條件作為供試品溶液的制備方法。同時(shí)由于丹參酮類成分對(duì)熱和光不穩(wěn)定，相互之間易于轉(zhuǎn)換，因此在測(cè)定過(guò)程中需采用棕色瓶子避光操作，同時(shí)超聲時(shí)注意溫度控制。

3.3 限度的確定

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)10個(gè)不同產(chǎn)地的丹參藥材中二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA的含量測(cè)定，按照2015年版《中國(guó)藥典》規(guī)定，按干燥品計(jì)算，含隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA三者之和不少于0.25%，上述藥材的含量均符合規(guī)定，本實(shí)驗(yàn)所測(cè)其他批次藥材中的二氫丹參酮中的含量在0.039 2%～0.071 4%之間，四者之和在0.444 9%～0.774 1%之間，平均值為0.603 2%，因此建議規(guī)定中增加二氫丹參酮的含量，以平均值的80%計(jì)算作為限度較為合理，因此為了提高優(yōu)質(zhì)丹參藥材標(biāo)準(zhǔn)，丹參藥材按照干燥品計(jì)算，含二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA四者之和不少于0.48%。

本研究建立的不同產(chǎn)地丹參藥材中脂溶性成分二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA的TLC鑒別方法，具有斑點(diǎn)清晰、分離良好、含量測(cè)定方法分析速度快、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，可以用于丹參藥材中4種脂溶性成分的含量測(cè)定。