姜錦惠，趙 悅，李盈爍，魏麗麗，趙 越，楊雪萌，潘國楊，烏日娜

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院 遼寧省食品發(fā)酵技術(shù)工程研究中心 沈陽市微生物發(fā)酵技術(shù)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽 110866）

東北豆醬作為我國傳統(tǒng)調(diào)味食品，因其獨(dú)特的滋味與氣味而受到大眾普遍歡迎[1]。在酶的作用下，大豆中的鐵、磷、鈣等礦物質(zhì)能更容易的被釋放，從而使大豆中的營養(yǎng)成分更易于人體消化吸收[2-3]。在豆醬自然發(fā)酵過程中，乳酸菌可以利用大豆中的蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪等，分解成小分子醛、酸、酯等風(fēng)味物質(zhì)，使得豆醬的養(yǎng)分發(fā)生變化，進(jìn)而影響豆醬的風(fēng)味[4-5]。

嗜鹽四聯(lián)球菌（Tetragenococcus halophilus）是一類廣泛存在于豆醬、醬油、泡菜等含鹽發(fā)酵食品中的乳酸菌。已有研究表明，把從中國傳統(tǒng)發(fā)酵食品豆瓣醬中篩選出的一株嗜鹽四聯(lián)球菌菌株作為發(fā)酵劑添加至豆瓣醬的發(fā)酵過程中，豆瓣醬中的揮發(fā)性物質(zhì)如氨基酸態(tài)氮、酸類、酯類等含量均有提高，其有助于豆瓣醬整體滋味與品質(zhì)的提升，對(duì)發(fā)酵產(chǎn)品有明顯的增益作用[6]。此外，將嗜鹽四聯(lián)球菌用于強(qiáng)化豆瓣醬的風(fēng)味，豆瓣醬中的揮發(fā)性成分如氨基酸態(tài)氮、酸類、醇類等均有所提高，而亞硝酸鹽含量減少39.4%

[7]。有大量研究表明，乳酸菌作為重要的微生物在傳統(tǒng)食品發(fā)酵過程中對(duì)風(fēng)味物質(zhì)的形成有著至關(guān)重要的作用，雖然國內(nèi)外對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵食品的生產(chǎn)工藝、感官品質(zhì)、理化指標(biāo)等做了大量的研究，但對(duì)其中嗜鹽乳酸菌分離篩選的研究相對(duì)較少。

該試驗(yàn)從傳統(tǒng)自然發(fā)酵豆醬中分離嗜鹽四聯(lián)球菌菌株[8-10]，采用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)其進(jìn)行鑒定[11-13]，并對(duì)菌株益生特性進(jìn)行研究，篩選益生性優(yōu)良的嗜鹽四聯(lián)球菌菌株。進(jìn)一步探討優(yōu)良菌株的最佳生長條件，并以活菌數(shù)為響應(yīng)值，采用單因素及響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)對(duì)其增殖培養(yǎng)基組分進(jìn)行優(yōu)化，為嗜鹽四聯(lián)球菌進(jìn)一步地開發(fā)與應(yīng)用提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌株

高鹽自然發(fā)酵豆醬樣品：采集自遼寧省，共計(jì)14份。

大腸桿菌（Escherichia coli）、單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）：中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 試劑

脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：美國OMEGA公司；AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒：美國AXYGEN公司；FastpfuDNAPolymerase：北京TransGen公司；瓊脂糖（生化試劑）：西班牙沃比森公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物、擴(kuò)增體系：北京鼎國昌盛有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純或生化試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基[14]：蛋白胨10 g，牛肉膏8 g，酵母提取物4 g，葡萄糖20 g，乙酸鈉·3H2O 5 g，吐溫80 1 g，K2HPO42 g，檸檬酸鈉2 g，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，氯化鈉150 g，那他霉素2 g，碳酸鈣10 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

MRS液體培養(yǎng)基[15]：蛋白胨10 g，無水乙酸鈉3 g；K2HPO42 g；MgSO4·7H2O 0.575 g；MnSO4·H2O 0.25 g，葡萄糖20 g，檸檬酸三鈉2.42 g，酵母粉4 g，牛肉浸膏8 g，吐溫80 1 g，瓊脂（半固體）1.75 g，蒸餾水1 000 mL。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。MRS固體培養(yǎng)基：MRS液體培養(yǎng)基中添加瓊脂20 g。

LB液體培養(yǎng)基[16]：酵母粉5 g，蛋白胨10 g，NaCl 10 g，蒸餾水1 000 mL。121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

種子培養(yǎng)基[17]：MRS液體培養(yǎng)基中添加氯化鈉100.0g/L，pH 7.0。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

SHP-250型生化培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；ZHJH-C1112C超凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；ABI-2720 PCR儀：美國AppliedBiosytems公司；DYY-12電泳儀：北京六一生物儀器有限公司；UVPGDS-8000凝膠成像儀：上海精密科學(xué)有限公司；Centrifuge 5804R高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)：德國Eppendorf公司；NanoDrop 2000c超微量分光光度計(jì)：美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 自然發(fā)酵豆醬中耐鹽乳酸菌的初步分離及純化

將自然發(fā)酵豆醬樣品通過10倍稀釋法用生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋，然后選取2～3個(gè)合適梯度的稀釋液涂布于分離培養(yǎng)基中，于30 ℃條件下兼性厭氧培養(yǎng)6 d。挑取單菌落接種到MRS固體培養(yǎng)基純化2～3次。將分離得到的菌株接種于MRS固體培養(yǎng)基，30 ℃條件下培養(yǎng)60 h，挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，采用顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，記錄菌落特征，從而獲得嗜鹽四聯(lián)球菌疑似菌株。

1.3.2 生理生化試驗(yàn)

參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[18]對(duì)菌株進(jìn)行生理生化試驗(yàn)。

1.3.3 分子生物學(xué)鑒定

采用試劑盒法提取分離菌株的基因組DNA，采用微量紫外分光光度計(jì)對(duì)基因組DNA進(jìn)行濃度和純度的測(cè)定，以其為模板，利用16S rRNA基因通用引物[19-20]27f（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）、1492r（5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'）PCR擴(kuò)增16S rDNA基因序列。PCR擴(kuò)增體系：基因組DNA模板1 μL（50 ng/μL），引物27f、1492r各0.5 μL（25 pmol/μL），10×PCR buffer 2.5 μL，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）MIX 2 μL，ExTaq酶0.2 μL，雙蒸水（ddH2O）18.3 μL；PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，27個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后委托上海桑尼生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序[21-23]。將測(cè)序結(jié)果提交至美國國立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫中，采用基本局部比對(duì)搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）進(jìn)行同源性對(duì)比搜索，選取同源性較高的模式菌株的16S rDNA基因序列，采用MEGA軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[24-25]。

1.3.4 嗜鹽四聯(lián)球菌耐受性試驗(yàn)

將分離并鑒定到的嗜鹽四聯(lián)球菌菌株分別接種于種子培養(yǎng)基，30 ℃靜置培養(yǎng)24 h，作為種子液，備用。

按2%（V/V）的接種量將嗜鹽四聯(lián)球菌種子液接種于5 mL MRS液體培養(yǎng)基中，30 ℃、100 r/min搖床培養(yǎng)24 h后，取培養(yǎng)液2 mL，12 000 r/min離心2 min，收集菌體，在超凈工作臺(tái)中倒掉上清液并加2 mL滅菌生理鹽水進(jìn)行重懸；吸取菌懸液0.5 mL分別加入到4.5 mL pH 3.0鹽酸溶液、0.3%膽鹽溶液和滅菌生理鹽水中，30 ℃、100 r/min條件下培養(yǎng)4 h，取500 μL上述處理液到5 mL的MRS液體培養(yǎng)基中，30 ℃、100 r/min條件下培養(yǎng)8 h后，采用超微量分光光度計(jì)在波長600 nm處測(cè)定吸光度值（OD600nm值），并計(jì)算菌株存活率，其計(jì)算公式如下：

式中：A表示生理鹽水培養(yǎng)液的吸光度值；B表示各處理培養(yǎng)液的吸光度值。

1.3.5 嗜鹽四聯(lián)球菌抑菌性試驗(yàn)

按2%的接種量將嗜鹽四聯(lián)球菌種子液接種到MRS液體培養(yǎng)基中，在30 ℃的條件下培養(yǎng)24 h。將發(fā)酵液在4 ℃、10 000 r/min條件下離心10 min，取上清液過濾除菌，保存?zhèn)溆?。將大腸桿菌（Escherichia coli）、單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）及金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）作為指示菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃條件下培養(yǎng)24 h。參照麥?zhǔn)媳葷峁?，用無菌生理鹽水將指示菌懸液菌體濃度稀釋成105CFU/mL，取100 μL均勻涂布在LB固體培養(yǎng)基上，用無菌鑷子在每個(gè)培養(yǎng)皿中等距離的放置3個(gè)牛津杯，在每個(gè)牛津杯中加100 μL嗜鹽四聯(lián)球菌發(fā)酵液，在4 ℃靜置1 h。用游標(biāo)卡尺量取抑菌圈的直徑，每組做三個(gè)平行試驗(yàn)取其平均值。抑菌圈直徑＞8 mm時(shí)有抑菌作用[26]。

1.3.6 嗜鹽四聯(lián)球菌最適培養(yǎng)條件的測(cè)定及菌體生長曲線

將嗜鹽四聯(lián)球菌種子液按3%（V/V）的接種量接種于初始pH值為7、NaCl含量為5%的MRS液體培養(yǎng)基中，33 ℃條件下靜置培養(yǎng)32 h，每隔2 h測(cè)定其活菌數(shù)值，三次重復(fù)取均值。在此基礎(chǔ)上考察接種量（1%、2%、3%、4%、5%）（V/V）、培養(yǎng)溫度（27 ℃、30 ℃、33 ℃、35 ℃、37 ℃）、NaCl含量（0、2%、5%、8%、10%）、初始pH值（5、6、7、8、9）對(duì)嗜鹽四聯(lián)球菌活菌數(shù)的影響。

將嗜鹽四聯(lián)球菌種子液按最適接種量接種于含最適NaCl含量的MRS液體培養(yǎng)基中，在最適培養(yǎng)條件下靜置培養(yǎng)，每2 h取樣測(cè)定活菌數(shù)，以培養(yǎng)時(shí)間（x）為橫坐標(biāo)，活菌數(shù)（y）為縱坐標(biāo)為繪制菌株生長曲線。

1.3.7 嗜鹽四聯(lián)球菌增殖培養(yǎng)基成分優(yōu)化

單因素試驗(yàn)：在最適培養(yǎng)條件下，以MRS液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別采用葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、玉米糊精作為培養(yǎng)基的唯一碳源，添加量為2%，考察碳源種類對(duì)嗜鹽四聯(lián)球菌活菌數(shù)的影響；確定最適碳源后，考察碳源添加量（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）對(duì)嗜鹽四聯(lián)球菌活菌數(shù)的影響。然后，分別采用蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、硫酸銨作為培養(yǎng)基的唯一氮源，添加量2.5%，考察氮源種類對(duì)嗜鹽四聯(lián)球菌活菌數(shù)的影響；確定最適氮源后，考察氮源添加量（1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%）對(duì)嗜鹽四聯(lián)球菌活菌數(shù)的影響。最后，以未添加果蔬汁的培養(yǎng)基為對(duì)照，分別加入胡蘿卜汁、玉米汁、番茄汁、黃豆?jié){，添加量為4%，考察生長因子種類對(duì)嗜鹽四聯(lián)球菌活菌數(shù)的影響；確定最適生長因子后，考察其添加量（2%、4%、6%、8%）對(duì)嗜鹽四聯(lián)球菌活菌數(shù)的影響。以上試驗(yàn)均在最適培養(yǎng)條件下靜置培養(yǎng)18 h后測(cè)定其活菌數(shù)，比較不同碳源、氮源、生長因子條件下菌體的生長情況。

響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)：在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以活菌數(shù)（Y）為響應(yīng)值，選擇葡萄糖（A）、蛋白胨（B）和黃豆?jié){（C）為考察因素，選用Box-Benhnken設(shè)計(jì)法設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，對(duì)嗜鹽四聯(lián)球菌增殖培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 嗜鹽四聯(lián)球菌疑似菌株的分離及純化

根據(jù)乳酸菌的菌落形態(tài)特征從自然發(fā)酵豆醬中初步分離出68株耐鹽乳酸菌。進(jìn)一步應(yīng)用革蘭染色進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，并通過生長試驗(yàn)、脫脂乳試驗(yàn)以及過氧化氫酶試驗(yàn)等生理生化試驗(yàn)，初步篩選出15株嗜鹽四聯(lián)球菌疑似菌株。

2.2 嗜鹽四聯(lián)球菌疑似菌株的分子生物學(xué)鑒定

15株嗜鹽四聯(lián)球菌疑似菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖1。由圖1 可知，10 株菌株為嗜鹽四聯(lián)球菌（Tetragenococcus halophilus），4株為戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）及1株為肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）。

圖1 基于16S rDNA基因序列15株菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of 15 strains based on 16S rDNA gene sequences

2.3 嗜鹽四聯(lián)球菌的耐受性

10株嗜鹽四聯(lián)球菌的耐酸、耐膽鹽性能見圖2。由圖2可知，10株嗜鹽四聯(lián)球菌在酸溶液中的存活率均＞30%，其中菌株YSJ-3、YSJ-4、YSJ-5及YSJ-10耐酸性較好；除菌株YSJ-6外，9株嗜鹽四聯(lián)球菌在膽鹽溶液的存活率均＞40%，其中菌株YSJ-1、YSJ-5、YSJ-10、YSJ-15的膽鹽耐受性較好。

圖2 嗜鹽四鏈球菌耐受性試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Result of tolerant test of Tetragenococcus halophilus

2.4 嗜鹽四聯(lián)球菌的抑菌性

10株嗜鹽四聯(lián)球菌對(duì)3種致病菌的抑制效果見表1。由表1可知，10株嗜鹽四聯(lián)球菌對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及單核細(xì)胞增生李斯特菌均具有抑菌作用，其中菌株YSJ-5、YSJ-11對(duì)致病菌的抑菌性較好。綜上，菌株YSJ-5具有較好的耐受性和抑菌性，為優(yōu)良的嗜鹽四聯(lián)球菌。

表1 嗜鹽四聯(lián)球菌對(duì)致病菌的抑制效果Table 1 Inhibitory effect of Tetragenococcus halophilus on pathogenic bacteria

2.5 優(yōu)良嗜鹽四聯(lián)球菌YSJ-5最適培養(yǎng)條件的確定

2.5.1 最適接種量的確定

不同接種量對(duì)優(yōu)良菌株YSJ-5生長的影響見圖3。由圖3可知，隨著接種量的升高，活菌數(shù)呈先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)接種量為3%時(shí)，培養(yǎng)18 h后活菌數(shù)最高達(dá)到0.28×109CFU/mL，確定最優(yōu)接種量為3%。

圖3 接種量對(duì)嗜鹽四聯(lián)球菌YSJ-5生長的影響Fig.3 Effect of inoculum on the growth of Tetragenococcus halophilus YSJ-5

2.5.2 最適培養(yǎng)溫度的確定

不同培養(yǎng)溫度對(duì)優(yōu)良菌株YSJ-5生長的影響見圖4。由圖4可知，隨著培養(yǎng)溫度的升高，活菌數(shù)呈先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)培養(yǎng)溫度為33 ℃時(shí)，培養(yǎng)18 h后活菌數(shù)最高達(dá)到0.29×109CFU/mL，確定最優(yōu)培養(yǎng)溫度為33 ℃。

圖4 培養(yǎng)溫度對(duì)嗜鹽四聯(lián)球菌YSJ-5生長的影響Fig.4 Effect of culture temperature on the growth of Tetragenococcus halophilus YSJ-5

2.5.3 最適NaCl含量的確定

不同NaCl含量對(duì)優(yōu)良菌株YSJ-5生長的影響見圖5。有研究發(fā)現(xiàn)[27]，嗜鹽四聯(lián)球菌最高可耐受NaCl含量26%，最適生長NaCl含量為5%～10%，大多數(shù)菌株在無NaCl的情況下也能生長。由圖5可知，隨著NaCl含量的升高，活菌數(shù)整體呈先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)NaCl含量為5%時(shí)，培養(yǎng)16 h后活菌數(shù)最高達(dá)到0.30×109CFU/mL，確定最優(yōu)NaCl含量為5%。

圖5 NaCl含量對(duì)嗜鹽四聯(lián)球菌YSJ-5生長的影響Fig.5 Effect of salt concentration on the growth of Tetragenococcus halophilus YSJ-5

2.5.4 初始pH值的確定

不同初始pH值對(duì)優(yōu)良菌株YSJ-5生長的影響見圖6。由圖6可知，隨著pH值的升高，活菌數(shù)整體呈先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)pH值為8時(shí)，培養(yǎng)16 h后活菌數(shù)最高達(dá)到0.35×109CFU/mL，確定最優(yōu)pH值為8.0。

圖6 初始pH值對(duì)嗜鹽四聯(lián)球菌YSJ-5生長的影響Fig.6 Effect of initial pH value on the growth of Tetragenococcus halophilus YSJ-5

2.5.5 嗜鹽四聯(lián)球菌YSJ-5的生長曲線

嗜鹽四聯(lián)球菌YSJ-5的最適培養(yǎng)條件為：接種量3%，培養(yǎng)溫度33 ℃，NaCl含量5%，pH值8.0。在最適生長條件下，菌株YSJ-5的生長曲線見圖7。

圖7 在最適生長條件下嗜鹽四聯(lián)球菌YSJ-5的生長曲線Fig.7 Growth curve of Tetragenococcus halophilus YSJ-5 under optimum growth conditions

由圖7可知，培養(yǎng)0～8 h為遲滯期，8～16 h為對(duì)數(shù)增長期，16～24 h為穩(wěn)定期，24 h后為衰亡期。培養(yǎng)16 h時(shí)，活菌數(shù)達(dá)到最高，為0.35×109CFU/mL。

2.6 嗜鹽四聯(lián)球菌YSJ-5增殖培養(yǎng)基組成優(yōu)化試驗(yàn)

2.6.1 碳源種類及添加量對(duì)菌株YSJ-5生長的影響

不同碳源及葡萄糖添加量對(duì)優(yōu)良嗜鹽四聯(lián)球菌菌株YSJ-5生長的影響見圖8。

由圖8a可知，蔗糖和葡萄糖的增殖效果要明顯優(yōu)于淀粉和麥芽糊精，當(dāng)碳源為葡萄糖時(shí)，菌株YSJ-5的活菌數(shù)最高，達(dá)到0.59×109CFU/mL。因此，確定最優(yōu)碳源為葡萄糖。由圖8b可知，隨著葡萄糖添加量的增大，菌株YSJ-5的活菌數(shù)呈先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)葡萄糖添加量為2.5%時(shí)，活菌數(shù)達(dá)到最高，為0.74×109CFU/mL。因此，確定葡萄糖最適添加量為2.5%。

圖8 碳源種類（a）及葡萄糖添加量（b）對(duì)嗜鹽四聯(lián)球菌YSJ-5生長的影響Fig.8 Effects of carbon source type (a) and glucose addition (b) on the growth of Tetragenococcus halophilus YSJ-5

2.6.2 氮源種類及添加量對(duì)菌株YSJ-5生長的影響

不同氮源及蛋白胨添加量對(duì)優(yōu)良嗜鹽四聯(lián)球菌菌株YSJ-5生長的影響見圖9。

圖9 氮源種類（a）及蛋白胨添加量（b）對(duì)嗜鹽四聯(lián)球菌YSJ-5生長的影響Fig.9 Effects of nitrogen source type(a)and peptone addition(b)on the growth of Tetragenococcus halophilus YSJ-5

由圖9a可知，當(dāng)?shù)礊榈鞍纂藭r(shí)，菌株YSJ-5的活菌數(shù)最高，達(dá)到0.90×109CFU/mL。因此，確定最優(yōu)氮源為蛋白胨。由圖9b可知，隨著蛋白胨添加量的增大，菌株YSJ-5的活菌數(shù)呈先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)?shù)鞍纂颂砑恿繛?.5%時(shí)，活菌數(shù)達(dá)到最高，為0.90×109CFU/mL。因此，確定蛋白胨最適添加量為2.5%。

2.6.3 生長因子種類及添加量對(duì)菌株YSJ-5生長的影響

生長因子種類及添加量對(duì)嗜鹽四聯(lián)球菌YSJ-5生長的影響見圖10。由圖10a可知，各生長因子對(duì)嗜鹽四聯(lián)球菌YSJ-5均有增菌效果，黃豆?jié){的增菌效果最為明顯，培養(yǎng)18 h后，活菌數(shù)達(dá)到1.61×109CFU/mL。因此確定最優(yōu)生長因子為黃豆?jié){。由圖10b可知，隨著黃豆?jié){添加量的增加，嗜鹽四聯(lián)球菌YSJ-5的活菌數(shù)呈先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)黃豆?jié){添加量增至4%時(shí)，活菌數(shù)達(dá)到最高，為1.62×109CFU/mL。因此，確定黃豆?jié){的最優(yōu)添加量為4%。

圖10 生長因子種類（a）及黃豆?jié){添加量（b）對(duì)嗜鹽四聯(lián)球菌YSJ-5生長的影響Fig.10 Effects of growth factor type (a) and soybean milk addition (b)on the growth of Tetraphylococcus halophilus YSJ-5

2.6.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

依據(jù)Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以前期培養(yǎng)條件優(yōu)化及培養(yǎng)基優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，選取葡萄糖（A）、蛋白胨（B）和黃豆?jié){（C）添加量為考察因素，嗜鹽四聯(lián)球菌YSJ-5活菌數(shù)（Y）為響應(yīng)值，利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化嗜鹽四聯(lián)球菌YSJ-5的增殖培養(yǎng)基組分，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2，方差分析見表3。

采用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)表2試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，得到自變量的回歸模型方程為Y=219.20+44.75A-27.38B+11.13C+4.75AB+33.25AC+7.50BC-67.85A2-46.10B2-65.60C2。由表3可知，模型極顯著（P＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），表明方程與實(shí)際數(shù)據(jù)能夠良好擬合，此試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果較為可靠，可用于優(yōu)化嗜鹽四聯(lián)球菌YSJ-5的增殖培養(yǎng)基組分。由表3亦可知，一次項(xiàng)A、B、交互項(xiàng)AC及二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），一次項(xiàng)C對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05），其他項(xiàng)對(duì)結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。其中交互項(xiàng)AC對(duì)結(jié)果影響的響應(yīng)面及等高線見圖11。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of the response surface tests

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果的方差分析Table 3 Variance analysis of response surface tests

由圖11可知，響應(yīng)面呈曲凸面，等高線呈橢圓形，說明葡萄糖添加量與黃豆?jié){添加量間的交互作用對(duì)嗜鹽四聯(lián)球菌YSJ-5活菌數(shù)的影響顯著（P＜0.05），與方差分析結(jié)果一致。

應(yīng)用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)回歸模型方程進(jìn)行分析，得出最優(yōu)增殖培養(yǎng)基組成為：葡萄糖添加量2.70%，蛋白胨添加量2.36%，黃豆?jié){添加量4.41%，嗜鹽四聯(lián)球菌YSJ-5活菌數(shù)的預(yù)測(cè)值為2.31×109CFU/mL。在最優(yōu)條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，嗜鹽四聯(lián)球菌YSJ-5培養(yǎng)18 h后的活菌數(shù)實(shí)際值為2.20×109CFU/mL，與理論預(yù)測(cè)值相近，是優(yōu)化前活菌數(shù)（3.50×108CFU/mL）的6.31倍。因此，應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化所得到的增殖培養(yǎng)基組成參數(shù)準(zhǔn)確可靠，同時(shí)也具有一定實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié)論

本研究采用傳統(tǒng)培養(yǎng)分離方法，從遼寧地區(qū)14份傳統(tǒng)自然發(fā)酵豆醬樣品中初步分離出68株耐鹽乳酸菌株，通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化試驗(yàn)，初步篩選出15株嗜鹽四聯(lián)球菌疑似菌株。采用分子生物學(xué)技術(shù)鑒定，其中10株為嗜鹽四聯(lián)球菌。由耐受性試驗(yàn)可知，菌株YSJ-3、YSJ-4、YSJ-5、YSJ-10對(duì)酸溶液耐受性較好，菌株YSJ-1、YSJ-3、YSJ-4、YSJ-5、YSJ-10、YSJ-15對(duì)膽鹽的耐受性較好，說明菌株YSJ-3、YSJ-4、YSJ-5、YSJ-10的益生性較好。由抑菌性試驗(yàn)可知，菌株YSJ-5、YSJ-11對(duì)致病菌的抑菌性較好，其中YSJ-5的抑菌性較YSJ-11更好。因此，確定菌株YSJ-5菌株為優(yōu)良菌株。該菌株的最適培養(yǎng)條件為接種量3%（V/V）、培養(yǎng)溫度33 ℃、NaCl含量5%、初始pH值8.0，在此條件下，其培養(yǎng)16 h時(shí)達(dá)到穩(wěn)定期，OD600nm值達(dá)到最高為1.822。在最適培養(yǎng)條件下，通過單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)確定菌株YSJ-5的最優(yōu)增殖培養(yǎng)基組成為葡萄糖2.70%、蛋白胨2.36%、黃豆?jié){4.41%，其他成分及添加量與基礎(chǔ)MRS液體培養(yǎng)基一致，在此最優(yōu)培養(yǎng)基組成下，菌株YSJ-5的活菌數(shù)達(dá)到2.20×109CFU/mL。