耿海波

（石家莊職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品與藥品工程系，河北 石家莊 050081）

酵母是一類包括釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和非常規(guī)酵母在內(nèi)的能發(fā)酵糖類的多種單細胞真核微生物的總稱，主要分布在偏酸性含糖量較高的環(huán)境中[1]，其中釀酒酵母是工業(yè)生產(chǎn)中重要的微生物類群，它們可合成的天然產(chǎn)物超過100種[2]，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥保健、輕工、能源化工和生命科學(xué)等多個領(lǐng)域，尤其是在發(fā)酵食品和啤酒、葡萄酒等酒精類產(chǎn)品的發(fā)酵方面具有重要的作用[3]，現(xiàn)如今全世界酒精年產(chǎn)量已超過一億t[4]。

釀酒酵母在發(fā)酵過程中，尤其是在果酒生產(chǎn)中，經(jīng)常會遇到強酸性、高糖、高酒精環(huán)境，這對酵母的耐酸性能提出了很高的要求。目前，國外科研工作者通過基因重組技術(shù)以獲取耐酸性較強且產(chǎn)量高的釀酒酵母[5-6]，但是基因重組技術(shù)獲得的耐酸性能不夠穩(wěn)定。國內(nèi)研究人員通常選擇傳統(tǒng)的篩選方法對釀酒酵母進行選育，同時對釀酒酵母耐酸機理展開研究[7]，并將其應(yīng)用于白酒和果酒的生產(chǎn)[8-10]。獲得的釀酒酵母對于糖的利用能力、酒精生產(chǎn)能力、高糖和高酒精環(huán)境耐受性能等方面雖然有了很大的進步[11-12]，但是對于耐酸性的高產(chǎn)菌株篩選工作仍有待進一步深化。

本研究采用酸性選擇培養(yǎng)基、氯化三苯基四氮唑（triphenyltetrazolium chloride，TTC）顯色法、杜氏小管發(fā)酵法從實驗室保藏的87株釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中篩選出耐酸性強的優(yōu)良菌株，并測定其最適生長條件、耐受性及發(fā)酵性能，以期為后續(xù)果酒釀造工作研究提供優(yōu)質(zhì)的菌種[13-14]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

87株釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）（編號為SC-1～SC-87）：為前期研究利用皂素廢水發(fā)酵酒精時篩選并保存于本實驗室的具有一定耐酸性的實驗菌株[15]。

1.1.2 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeastextractpeptonedextrose，YPD）培養(yǎng)基[16]：酵母浸粉10.0 g，蛋白胨20.0 g，溶于900 mL蒸餾水中，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min；另取葡萄糖20.0 g溶于100 mL蒸餾水中，115 ℃高壓蒸汽滅菌15 min后與上述溶液混勻，pH自然。如配制固體培養(yǎng)基另加入20.0 g瓊脂粉。

WL營養(yǎng)瓊脂（wallerstein laboratory nutrient agar，WL）培養(yǎng)基[17]：酵母浸粉4.0 g，蛋白胨5.0 g，KH2PO40.55 g，KCl 0.425 g，CaCl20.125 g，MgSO4·7H2O 0.125 g，F(xiàn)eCl30.002 5 g，MnSO40.002 5 g，瓊脂粉20.0 g，加入溴甲酚綠22.0 mg，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min；另取葡萄糖50.0 g溶于100 mL蒸餾水中，115 ℃高壓蒸汽滅菌15 min后與上述溶液混勻，pH自然。

TTC培養(yǎng)基[18]：TTC上層培養(yǎng)基：葡萄糖0.5 g，瓊脂粉15.0 g，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，待冷卻后加入TTC 0.5 g。TTC下層培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，酵母浸粉7.5 g，KH2PO45.0 g，MgSO4·7H2O 2.0 g，檸檬酸1.35 g，氨芐青霉素1.0 g，瓊脂粉30.0 g，溶于900 mL蒸餾水中，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min；另取葡萄糖50.5 g溶于100 mL蒸餾水中，115 ℃高壓蒸汽滅菌15 min后與上述溶液混勻，pH 4.0。

1.1.3 主要試劑

酵母浸粉、蛋白胨、葡萄糖、瓊脂粉、乳酸、無水乙醇、KH2PO4、KCl、CaCl2、MgSO4·7H2O、FeCl3、MnSO4、NaCl：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；溴甲酚綠：上海源葉生物科技有限公司；氨芐青霉素：北京索萊寶科技有限公司。實驗所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

YJ-VS-1型單人垂直超凈工作臺：無錫一凈凈化設(shè)備有限公司；LDZX-50L型高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；DHP-9602電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；BS-2E型恒溫振蕩培養(yǎng)箱：常州恒隆儀器有限公司；UV-1900i型紫外-可見分光光度計：島津企業(yè)管理（中國）有限公司；ME204型電子分析天平、FE22型pH計：梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司；PAL-1糖度儀：廣州市愛宕科學(xué)儀器有限公司；A8964酒精計：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 釀酒酵母菌株的活化

在無菌環(huán)境下分別挑取實驗室保藏的87株釀酒酵母，接種到Y(jié)PD固體斜面培養(yǎng)基上，于28 ℃培養(yǎng)24 h；挑取上述菌株移接入100 mL YPD液體培養(yǎng)基中，于28 ℃靜置培養(yǎng)24 h；再移接入100 mL YPD液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)24 h作為種子液，備用。

1.3.2 優(yōu)良耐酸釀酒酵母菌株的篩選

用乳酸調(diào)節(jié)YPD液體培養(yǎng)基pH值為2.0，按5%（V/V）的接種量接入釀酒酵母種子液，于28 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)24 h后，取菌懸液劃線于WL固體培養(yǎng)基，于28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，挑取生長狀況較好的典型的單菌落，接種到Y(jié)PD固體斜面保藏，用于后續(xù)篩選[19]。

TTC顯色法篩選[20-21]：用接種環(huán)挑取釀酒酵母菌株在TTC下層培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線，于28 ℃培養(yǎng)48 h，將融化并冷卻至45～50 ℃的TTC上層培養(yǎng)基倒入TTC下層培養(yǎng)基表面，于28 ℃培養(yǎng)3 h后，觀察培養(yǎng)基顯色情況，從中篩選出產(chǎn)酒精能力較強的菌株。

杜氏小管發(fā)酵法篩選[22]：取0.5 mL釀酒酵母種子液于裝有10 mL YPD液體培養(yǎng)基的試管中，倒置放入杜氏小管，并避免杜氏小管內(nèi)有氣體存在，密封后于28 ℃靜置培養(yǎng)，每隔12 h觀察并記錄杜氏小管內(nèi)產(chǎn)氣情況，篩選出生長和發(fā)酵性能較好的菌株。

1.3.3 優(yōu)良耐酸釀酒酵母菌株生長特征的測定

最適生長溫度：按5%（V/V）的接種量將釀酒酵母種子液接種于100mLYPD液體培養(yǎng)基中，分別于不同溫度（22℃、24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃）、160 r/min條件下振蕩培養(yǎng)，每組平行三份，以不加菌的YPD液體培養(yǎng)基為對照，培養(yǎng)24 h后使用紫外-可見分光光度計在波長600 nm處測定菌液的OD600nm值。

最適生長pH值：用乳酸調(diào)節(jié)YPD液體培養(yǎng)基的pH值為3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0，按5%（V/V）的接種量將釀酒酵母種子液接種于100 mL不同pH值的YPD液體培養(yǎng)基中，在最適溫度、160 r/min條件下振蕩培養(yǎng)，每組平行三份，培養(yǎng)24 h后測定菌液的OD600nm值。

生長曲線的測定[23]：按最適pH值配制YPD液體培養(yǎng)基，按5%（V/V）的接種量將釀酒酵母種子液接種于100 mL YPD液體培養(yǎng)基中，在最適溫度、160 r/min條件下振蕩培養(yǎng)，每組平行三份，每2 h取樣測定菌液的OD600nm值，以發(fā)酵時間（x）為橫坐標(biāo)，OD600nm值（y）為縱坐標(biāo)繪制生長曲線。

1.3.4 優(yōu)良耐酸釀酒酵母菌株耐受性的測定

乙醇耐受性測定：按體積比在YPD液體培養(yǎng)基中加入6%、8%、10%、12%、14%、16%、18%無水乙醇，按5%（V/V）的接種量將釀酒酵母種子液接種于100 mL YPD液體培養(yǎng)基中，在最適培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)48 h后測定菌液的OD600nm值。

鹽耐受性能測定[24]：在YPD液體培養(yǎng)基中加入NaCl，使培養(yǎng)基中NaCl含量為10 g/L、30 g/L、50 g/L、70 g/L、100 g/L、150 g/L、200 g/L，按5%（V/V）的接種量將釀酒酵母種子液接種于100 mL YPD液體培養(yǎng)基中，在最適培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)一周，并觀察菌株是否有生長。

糖耐受性能測定[24]：調(diào)整YPD液體培養(yǎng)基中葡萄糖的質(zhì)量濃度分別為200 g/L、300 g/L、400 g/L、500 g/L、600 g/L，按5%（V/V）的接種量將釀酒酵母種子液接種于100 mL YPD液體培養(yǎng)基中，在最適培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)一周，并觀察菌株是否有生長。

1.3.5 優(yōu)良耐酸釀酒酵母菌株發(fā)酵性能的測定[25]

按5%（V/V）的接種量將釀酒酵母種子液接種于100 mL YPD液體培養(yǎng)基中，稱質(zhì)量后在最適培養(yǎng)條件下振蕩培養(yǎng)，每24 h稱一次質(zhì)量，按國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測定發(fā)酵力、總糖、總酸、揮發(fā)酸含量及酒精度。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2019對數(shù)據(jù)進行整理和作圖，數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)良耐酸釀酒酵母菌株的篩選

2.1.1 釀酒酵母菌株耐酸性能的測定

從87株釀酒酵母中篩選得到5株耐酸性能較好的釀酒酵母菌株，分別為菌株SC-6、SC-15、SC-19、SC-55、SC-62，其生長情況見表1。

表1 釀酒酵母菌株耐酸性能的測定結(jié)果Table 1 Determination results of acid tolerance of Saccharomyces cerevisiae strains

2.1.2 釀酒酵母菌株產(chǎn)酒精能力的測定

5株釀酒酵母菌株的產(chǎn)酒精能力見表2。由表2可知，菌株SC-6、SC-15、SC-62的產(chǎn)酒精能力相對較強。

表2 5株釀酒酵母菌株產(chǎn)酒精能力的測定結(jié)果Table 2 Determination results of alcohol production capacity of 5 Saccharomyces cerevisiae strains

2.1.3 釀酒酵母菌株產(chǎn)氣能力的測定

5株釀酒酵母菌株的產(chǎn)氣情況見表3。

表3 5株釀酒酵母菌株產(chǎn)氣能力的測定結(jié)果Table 3 Determination results of gas production capacity of 5 Saccharomyces cerevisiae strains

由表3可知，菌株SC-15和SC-62的產(chǎn)氣能力最強，在24 h時已經(jīng)使杜氏小管中充有一半氣體，在36 h時杜氏小管中已經(jīng)充滿CO2氣體。結(jié)合TTC顯色實驗結(jié)果，故選擇菌株SC-15和SC-62為優(yōu)良耐酸釀酒酵母菌株。

2.2 優(yōu)良耐酸釀酒酵母菌株的生長特征

2.2.1 最適生長溫度的測定結(jié)果培養(yǎng)溫度對釀酒酵母SC-15和SC-62生長的影響見圖1。

圖1 培養(yǎng)溫度對兩株釀酒酵母菌株的影響Fig.1 Effects of culture temperature on 2 Saccharomyces cerevisiae strains

由圖1可知，釀酒酵母SC-15和SC-62均在28 ℃時生長最好，OD600nm值達到最大，分別為1.80和1.89。菌株SC-62在26～32 ℃的范圍內(nèi)OD600nm值均高于菌株SC-15，尤其是在30 ℃時，菌株SC-62的OD600nm值與28 ℃時變化不明顯，呈現(xiàn)出更強的溫度適應(yīng)能力。綜上，菌株SC-15和SC-62的最適生長溫度均為28 ℃，且菌株SC-62的溫度適應(yīng)能力更強。

2.2.2 最適生長pH值的測定結(jié)果

培養(yǎng)基初始pH對釀酒酵母SC-15和SC-62生長的影響見圖2。

圖2 初始pH值對兩株釀酒酵母菌株的影響Fig.2 Effects of initial pH value on 2 Saccharomyces cerevisiae strains

由圖2可知，pH值變化對兩株菌生長的影響存在差異，菌株SC-15在初始pH值為3.8～4.8之間生長良好，有較寬的pH值適應(yīng)范圍，其最適pH值為4.4，而菌株SC-62在初始pH值為3.6～4.4之間生長旺盛，最適pH值為4.0。在pH值3.0～4.2范圍內(nèi)，菌株SC-62的OD600nm值高于菌株SC-15，說明菌株SC-62具備更強的耐酸特性。綜上，菌株SC-15和SC-62的最適生長pH值分別為4.4、4.0，且菌株SC-62具備更強的耐酸特性。

2.2.3 生長曲線的測定結(jié)果

釀酒酵母SC-15和SC-62的生長曲線見圖3。

圖3 兩株釀酒酵母菌株的生長曲線Fig.3 Growth curves of 2 Saccharomyces cerevisiae strains

由圖3可知，兩株釀酒酵母菌株的生長規(guī)律類似，菌株SC-15在發(fā)酵0～14 h時生長速度較慢，為延滯期；在發(fā)酵14～22 h時進入迅速生長的對數(shù)期，之后進入穩(wěn)定期。與菌株SC-15相比，菌株SC-62的延滯期相對更短，在第12小時時進入對數(shù)期，達到穩(wěn)定期后的OD600nm值也稍高。在生產(chǎn)中延滯期短的菌株適應(yīng)能力更強，可在短時間內(nèi)形成數(shù)量優(yōu)勢，減少染菌機會同時減少副產(chǎn)物的形成，并有利于提高發(fā)酵效率。

2.3 優(yōu)良耐酸釀酒酵母菌株的耐受性

2.3.1 耐乙醇性能的測定結(jié)果

釀酒酵母SC-15和SC-62的耐乙醇性能見圖4。

圖4 兩株釀酒酵母菌株耐乙醇性能的測定結(jié)果Fig.4 Determination results of alcohol tolerance of 2 Saccharomyces cerevisiae strains

由圖4可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)在6%～8%時，兩株釀酒酵母生長狀況均良好；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)＞12%之后，兩株菌株受到較大的抑制，OD600nm值急劇下降；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)＞16%之后，兩株菌株的OD600nm值與剛接種時相同，說明釀酒酵母在此環(huán)境中被完全抑制。與菌株SC-15相比，菌株SC-62的耐乙醇性能較好，且優(yōu)于李彥芹等[24-25]研究菌株的耐受性。

2.3.2 耐鹽性能測定結(jié)果

釀酒酵母SC-15和SC-62的耐鹽性能見表4。

表4 兩株釀酒酵母菌株耐鹽性能的測定結(jié)果Table 4 Determination results of salt tolerance of 2 Saccharomyces cerevisiae strains

由表4可知，兩株釀酒酵母均能在NaCl質(zhì)量濃度≤70g/L的YPD液體培養(yǎng)基中生長，當(dāng)NaCl質(zhì)量濃度為100 g/L時，菌株SC-62仍可生長，可見菌株SC-62具有良好的耐鹽性能。

2.3.3 耐糖性能測定結(jié)果

釀酒酵母SC-15和SC-62的耐糖性能見表5。

表5 兩株釀酒酵母菌株耐糖性能的測定結(jié)果Table 5 Determination results of sugar tolerance of 2 Saccharomyces cerevisiae strains

由表5可知，菌株SC-15在葡萄糖質(zhì)量濃度≤400 g/L的YPD液體培養(yǎng)基中生長，而菌株SC-62具有相對更好的耐糖性能，可在葡萄糖質(zhì)量濃度≤500 g/L的YPD液體培養(yǎng)基中生長。

2.4 優(yōu)良耐酸酵母菌株發(fā)酵性能測定結(jié)果

釀酒酵母SC-15和SC-62的發(fā)酵性能見表6。

表6 兩株釀酒酵母菌株發(fā)酵性能的測定結(jié)果Table 6 Determination results of fermentation performance of 2 Saccharomyces cerevisiae strains

由表6可知，菌株SC-62具有更高的發(fā)酵力[5.93 g CO2/（100 mL·24 h）]，高于楊寬等[25]的研究結(jié)果，說明此菌株能充分利用培養(yǎng)基中的糖轉(zhuǎn)化為酒精，發(fā)酵后酒精度達到7.55%vol，達到了用于果酒發(fā)酵的要求，產(chǎn)生的揮發(fā)酸含量（0.61 g/L）也低于國標(biāo)GB 15037—2006《葡萄酒》中規(guī)定的葡萄酒中揮發(fā)酸含量≤1.2 g/L的限值，綜合性能優(yōu)于菌株SC-15，相比實驗室保存的原有菌株，菌株SC-62具備更好的耐酸、耐糖性能，同時具有延滯期短、可適應(yīng)較寬的溫度范圍等優(yōu)點，發(fā)酵力強，具備一定的應(yīng)用價值[15]。

3 結(jié)論

本研究采用酸性選擇培養(yǎng)基、TTC顯色法、杜氏小管發(fā)酵法從實驗室保藏的87株釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中篩選得到2株耐酸性強的優(yōu)良菌株，其中菌株SC-62綜合性能優(yōu)于菌株SC-15，最適生長溫度、pH分別為28 ℃、4.0，可耐受乙醇體積分?jǐn)?shù)14%、NaCl 100 g/L、葡萄糖500 g/L，具有發(fā)酵力[5.93 g CO2/（100 mL·24 h）]強，酒精產(chǎn)量（7.55%vol）高，延滯期（12 h）短、適應(yīng)性強等優(yōu)點。