李景輝，郭 瑩，，張 穎，李霄霄，盧 君，孟天毅，張翠英，肖冬光

（1.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院 天津市工業(yè)微生物重點實驗室 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津 300457；2.貴州國臺酒業(yè)股份有限公司，貴州 仁懷 564501）

醬香型白酒的發(fā)酵環(huán)境具有高溫、高酸、開放式和復(fù)雜微生物區(qū)系等特點[1]。在釀造過程中，嚴(yán)苛的發(fā)酵環(huán)境對網(wǎng)羅自空氣、生產(chǎn)工具、原料和高溫大曲等來源的微生物進行了不斷地馴化和富集，并形成了醬香型酒醅特殊的微生物群落結(jié)構(gòu)及其演化過程[2-4]。不同階段的微生物有序地對酒醅基質(zhì)進行分解、利用并產(chǎn)生豐富的釀酒酶系和代謝產(chǎn)物[5]，最終促使白酒中多種風(fēng)味成分產(chǎn)生。其中，酵母菌是酒精和風(fēng)味成分的主要貢獻者[1，6]，產(chǎn)物包括高級醇、有機酸和酯類物質(zhì)等。20世紀(jì)60年代，東方伊薩酵母菌（Issatchenkia orientalis）首次在文獻中被報道[7]，其是一種具有較強耐受性和產(chǎn)酒精、酯類物質(zhì)能力的酵母菌[8]；彭俊等[9]研究發(fā)現(xiàn)，來自酒醅的東方伊薩酵母菌能夠在高溫42 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)8%的環(huán)境中存活，且在液態(tài)發(fā)酵中的乙醇和乙酸乙酯產(chǎn)量可達8.2%和385.5 mg/L。

篩選較高耐受性同時高產(chǎn)酒精或風(fēng)味物質(zhì)的酵母菌對于提高白酒的產(chǎn)量、質(zhì)量有重要意義[10]，東方伊薩酵母菌具有這些特質(zhì)。熊小毛等[8]將低產(chǎn)高級醇的東方伊薩酵母菌制成強化曲并用于生產(chǎn)實驗，使得兼香型白酒三輪次原酒中正丙醇的含量下降了27.4%，出酒率提高了22.9%。目前，關(guān)于東方伊薩酵母菌在醬香型白酒堆積培菌中的應(yīng)用還未見報道。

本研究從醬香型酒醅中分離篩選產(chǎn)酒生香能力較強且適合醬香型白酒發(fā)酵環(huán)境的優(yōu)良菌株，通過形態(tài)觀察及分子生物學(xué)技術(shù)對其進行鑒定，并利用該菌株進行醬香型白酒的強化堆積培菌試驗，探究其對風(fēng)味物質(zhì)和微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響，為其在醬香型白酒中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料和試劑

玉米：市售；醬香型白酒一輪次堆積酒醅、成品大曲粉、醬香型白酒第四輪次糟醅（酸度為2.56 mmol/10 g，淀粉含量為19.64%）：茅臺鎮(zhèn)某酒廠；2-辛醇（色譜純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙醇（色譜純）：天津市江天化工技術(shù)有限公司；乳酸（色譜純）、乙酸（色譜純）：天津市津科精細(xì)化工研究所。

1.1.2 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基[11]：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L，pH自然，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

種子液培養(yǎng)基[11]：將玉米水解液的糖度調(diào)節(jié)至12°Bx，添加硫酸銨6 g/L，硫酸鎂1.2 g/L，磷酸氫二鉀2.4 g/L，pH自然，115 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

高粱汁培養(yǎng)基[11]：將高粱水解液的糖度調(diào)節(jié)至18°Bx，pH自然，115 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

堆積酒醅：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%的成品大曲粉與醬香型白酒第四輪次糟醅混勻。

1.2 儀器與設(shè)備

789013型氣相色譜（gas chromatography，GC）儀、MSD-5977B型氣質(zhì)聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀：美國安捷倫科技有限公司；固相微萃取手柄、50 μm CAR/DVB/PDMS纖維萃取頭：美國Supelco公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 酵母菌的分離篩選

酵母菌的分離和純化：取醬香型白酒一輪次堆積酒醅10 g，與90 mL無菌蒸餾水混合并充分振蕩30 min，按10倍梯度稀釋至10-7，吸取梯度稀釋液涂布于YPD培養(yǎng)基，30 ℃下恒溫培養(yǎng)24～72 h，挑取單菌落進行劃線純化，保藏于YPD斜面。

種子液的制備：從斜面上挑取1環(huán)酵母菌接種到5 mL種子培養(yǎng)基中，30 ℃恒溫靜置培養(yǎng)24 h后轉(zhuǎn)接于45 mL種子培養(yǎng)基中，相同條件繼續(xù)培養(yǎng)16 h。

液態(tài)發(fā)酵：吸取15 mL酵母種子液接種于135 mL高粱汁培養(yǎng)基中，30 ℃恒溫靜置培養(yǎng)7 d，設(shè)置3組平行實驗。發(fā)酵結(jié)束后測定發(fā)酵液的酒精度和乙酸乙酯含量。

1.3.2 菌株的鑒定

形態(tài)觀察：參照《伯杰士手冊》對純化后的菌株進行菌落和細(xì)胞形態(tài)觀察。

分子生物學(xué)鑒定：提取分離菌株的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA），以其為模板對菌株的26S rDNA基因序列進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增[12]，將PCR擴增產(chǎn)物委托天津金唯智生物科技有限公司進行測序。將測序結(jié)果提交到美國國立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫中采用基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，Blast）進行搜索比對分析，選取同源性較高的模式菌株的26S rDNA基因序列，使用MEGA5.1軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.3 菌株的耐受性試驗

采用杜氏管法[13]測定酵母菌株對乙醇（體積分?jǐn)?shù)8%～14%）、乙酸（0.1%～0.7%）和乳酸（2%～5%）的耐受能力；采用點平板法[14]測定其耐高溫能力（30～45 ℃）。

1.3.4 堆積培菌試驗

按照0、3%、5%、7%的接種量將酵母種子液分別接種于100 g堆積酒醅中，將加水量補至7%并充分混勻。按接種量從小到大依次將上述酒醅分別命名為酒醅1～4。之后分裝酒醅于三角瓶中，用6層紗布封口，30 ℃靜置培養(yǎng)48 h，設(shè)置3組平行實驗。發(fā)酵結(jié)束后測定酒醅中揮發(fā)性物質(zhì)（乙酸乙酯和乳酸乙酯、其他揮發(fā)性成分）的含量及細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)。

1.3.5 分析方法

酒精度：使用比重法測定[15]。

乙酸乙酯和乳酸乙酯：取50 g酒醅與5 mL無水乙醇、200 mL蒸餾水混勻，蒸餾并收集100 mL餾出液。使用0.22 μm濾膜過濾餾出液并裝入氣相小瓶中，利用氣相色譜法測定乙酸乙酯和乳酸乙酯含量[10]。

風(fēng)味物質(zhì)：采用氣相色譜-質(zhì)譜法[16]測定餾出液中的風(fēng)味成分，通過質(zhì)荷比在質(zhì)譜庫中的匹配度對被測物質(zhì)進行定性分析，以2-辛醇（840 mg/L）作為內(nèi)標(biāo)對其進行半定量分析。

細(xì)菌群落組成分析：將磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）（pH=8.0）和酒醅樣品充分混合，使用布氏漏斗反復(fù)過濾混合液體，重復(fù)3～5次。在7 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，收集底部菌泥，委托上海派諾森生物科技有限公司進行高通量測序和操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）聚類分析，使用云平臺分析細(xì)菌多樣性指數(shù)及群落組成變化情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌的分離與篩選

采用傳統(tǒng)培養(yǎng)分離方法共分離、純化得到20株酵母菌株，對分離、純化后的酵母菌進行液態(tài)發(fā)酵實驗，最終篩選得到7株有較高產(chǎn)酒精和乙酸乙酯能力的酵母菌，結(jié)果見表1。由表1可知，菌株GTY-837產(chǎn)乙酸乙酯能力最高，為361.30 mg/L，產(chǎn)酒能力為8.97%vol均顯著高于其他菌株（P＜0.05）。

表1 酵母菌產(chǎn)酒及乙酸乙酯能力測定結(jié)果Table 1 Determination results of the liquor and ethyl acetate producing ability of yeast

2.2 菌株GTY-837的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

菌株GTY-837的菌落及細(xì)胞形態(tài)見圖1。由圖1可知，菌株GTY-837的菌落呈不規(guī)則圓形，乳白色，隆起，質(zhì)地柔軟，表面覆有絨毛、略有光澤；細(xì)胞形態(tài)為短棒形或長卵形，營出芽生殖。參照《伯杰士手冊》初步鑒定該菌株為畢赤酵母屬（Pichiasp.）或伊薩酵母屬（Issatchenkiasp.）。

圖1 菌株GTY-837的菌落（a）及細(xì)胞（b）形態(tài)Fig.1 Colony (a) and cell (b) morphology of strain GTY-837

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定

基于26S rDNA基因序列構(gòu)建菌株GTY-837的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖2。

圖2 基于26S rDNA基因序列菌株GTY-837的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain GTY-837 based on 26S rDNA gene sequences

由圖2可知，菌株GTY-837與東方伊薩酵母菌（Issatchenkia orientalis）YZ4（EU394711.1：20-581）聚于一支，親緣關(guān)系最近，結(jié)合形態(tài)觀察結(jié)果，將該菌株鑒定為東方伊薩酵母菌（Issatchenkia orientalis）。

2.3 菌株GTY-837的耐受性試驗

菌株GTY-837對乙醇、乙酸、乳酸及高溫的耐受性見表2。由表2可知，菌株GTY-837能夠耐受乙醇體積分?jǐn)?shù)10%、乙酸0.5%、乳酸4.0%，且在40 ℃高溫下仍能生長。在醬香型白酒的生產(chǎn)過程中，第五輪次堆醅的酒精含量為1%vol～3%vol，發(fā)酵結(jié)束后酸度為2.4～2.6 mmol/10 g（以乙酸計），溫度為32～47 ℃[17]。耐受性試驗結(jié)果說明菌株GTY-837能夠適應(yīng)五輪次堆醅的發(fā)酵環(huán)境，而該菌株同時還具有較強的產(chǎn)酒生香能力，因此能夠用于酸性環(huán)境下的堆積培菌試驗。

表2 菌株GTY-837的耐受性試驗結(jié)果Table 2 Results of tolerance test of strain GTY-837

2.4 堆積培菌實驗

2.4.1 酒醅中乙酸乙酯和乳酸乙酯含量的測定

采用菌株GTY-837進行堆積培菌實驗，酒醅中乙酸乙酯和乳酸乙酯含量的測定結(jié)果見圖3。由圖3可知，酒醅2中乙酸乙酯和乳酸乙酯的含量最高，分別為1 080.21 mg/L和187.42 mg/L，與酒醅1相比提高了4 059.45%和70.99%；酒醅3中，2種酯類的含量明顯降低，酒醅4中2種酯類的含量大幅增加，這可能是由于接種量的改變對酒醅微生物菌群組成產(chǎn)生了不同的影響，如一些產(chǎn)酸菌豐度的增加可能會減弱菌株GTY-837的產(chǎn)酯性能[18]，具體原因有待進一步研究。

圖3 酒醅中乙酸乙酯和乳酸乙酯含量測定結(jié)果Fig.3 Determination results of ethyl acetate and ethyl lactate contents in fermented grains

2.4.2 酒醅中風(fēng)味成分分析

酒醅1和酒醅2中的揮發(fā)性成分測定結(jié)果見表3。

表3 酒醅中揮發(fā)性物質(zhì)檢測結(jié)果Table 3 Determination results of volatile components in fermented grains

由表3可知，在酒醅1中共檢測到23種揮發(fā)性物質(zhì)，其中酯類9種，醇類9種，芳香族3種，呋喃類1種，吡嗪類1種；而酒醅2中共檢測到22種揮發(fā)性物質(zhì)，其中酯類12種，醇類5種，芳香族1種，呋喃類3種，吡嗪類1種。

酯類：酯類物質(zhì)具有典型的水果香、花香味，是中國白酒的主要呈香成分。與酒醅1相比，酒醅2中乙酸乙酯（蘋果香氣、清香）、L（-）-乳酸乙酯、乙酸苯乙酯和丙酸乙酯的含量大幅增加，其中乙酸乙酯廣泛、大量存在于白酒中，是構(gòu)成酒體風(fēng)味的“第一大酯”。乳酸乙酯、月桂酸乙酯和肉豆蔻酸乙酯的含量明顯減少?？傮w上，酒醅中酯類物質(zhì)的種類和含量顯著增加。

醇類：醇類物質(zhì)是白酒中一類重要的呈香呈味物質(zhì)。與酒醅1相比，酒醅2中異丁醇（青草氣味）、正丁醇、異戊醇（割青草味）和正己醇等雜醇油的含量顯著減少。同時，酒醅2中乙醇含量也明顯減少，分析原因可能主要是菌株GTY-837利用乙醇生成了大量的乙酯類物質(zhì)[20]。

芳香族：酒醅2中苯乙醇（玫瑰香氣）的含量大幅增加且苯甲醛和苯乙醛的含量明顯減少。其中，苯乙醇是白酒中主要的芳香族物質(zhì)之一[21]。

呋喃類：酒醅2中呋喃類物質(zhì)的含量和種類均有增加，這類物質(zhì)屬于羰基化合物，在醬香型白酒中的含量較高。

吡嗪類：在酒醅1、2中均檢測到了2,3,5,6-四甲基吡嗪（tetramethylpyrazine，TTMP）（堅果味），酒醅2的TTMP含量較酒醅1有所下降，這可能是菌株GTY-837抑制了芽孢桿菌屬微生物的生長并導(dǎo)致吡嗪類物質(zhì)的含量降低[22]，實際原因需要深入探究。

2.5 堆積培菌對酒醅細(xì)菌群落組成的影響

堆積發(fā)酵結(jié)束時，入窖酒醅中的微生物主要為酵母菌和細(xì)菌。接種菌株GTY-837后酒醅中絕對優(yōu)勢真菌為酵母菌，而細(xì)菌群落的變化未知；另外，由2.4.1可知各酒醅中乙酸乙酯和乳酸乙酯的含量差異顯著。因此，為了進一步探究主要風(fēng)味成分含量發(fā)生變化的原因，對堆積過程細(xì)菌群落組成及其變化進行了測序并分析。

2.5.1 細(xì)菌群落測序數(shù)據(jù)分析

酒醅中細(xì)菌菌群的α-多樣性指數(shù)見表4。由表4可知，酒醅樣品中細(xì)菌的有效測序數(shù)為96 459～130 057條，細(xì)菌屬為217～334，Coverage指數(shù)為0.986～0.991，Chao1指數(shù)為1 660～2 586，Shannon指數(shù)為5.96～7.18。酒醅樣品的Coverage指數(shù)接近1，說明測序結(jié)果能反映絕大多數(shù)樣品細(xì)菌群落的信息；酒醅3中細(xì)菌屬最多且Chao1指數(shù)最大，說明細(xì)菌豐富度較高，酒醅2的Shannon指數(shù)最大，說明細(xì)菌多樣性較高。

表4 酒醅樣品中細(xì)菌群落α-多樣性分析結(jié)果Table 4 Results of α-diversity analysis of bacterial community in fermented grains

2.5.2 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

基于屬水平酒醅樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成分析結(jié)果見圖4。由圖4可知，堆積酒醅中有14個細(xì)菌屬的相對豐度＞1%，包括克羅彭斯特菌屬（Kroppenstedtia）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、枝芽孢菌屬（Virgibacillus）、海洋芽孢桿菌屬（Oceanobacillus）、Tepidimicrobium、Georgenia、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、嗜熱放線菌屬（Thermoactinomyces）、中國芽孢桿菌屬（Sinibacillus）、Caldicoprobacter、蔗糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和喜熱裂孢菌屬（Thermobifida）。

圖4 基于屬水平酒醅樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成分析結(jié)果Fig.4 Analysis result of bacterial community composition in fermented grains based on genus level

由圖4可知，酒醅樣品中5個共有細(xì)菌屬的相對豐度較高，分別為克羅彭斯特菌屬（Kroppenstedtia）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、枝芽孢菌屬（Virgibacillus）和海洋芽孢桿菌屬（Oceanobacillus）。其中，克羅彭斯特菌屬（Kroppenstedtia）的相對豐度為11.18%～32.94%，分別在酒醅1、2和4中的相對豐度最大；鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）的相對豐度為10.38%～29.45%，是酒醅3中的絕對優(yōu)勢菌屬；另外，芽孢桿菌屬（Bacillus）的相對豐度為8.72%～13.82%，枝芽孢菌屬（Virgibacillus）的相對豐度為8.26%～17.24%，海洋芽孢桿菌屬（Oceanobacillus）的相對豐度為5.54%～10.95%。

克羅彭斯特菌屬（Kroppenstedtia）是一種嗜熱菌屬[23]，主要存在于高溫大曲和堆積發(fā)酵酒醅[24]中，有報道稱克羅彭斯特菌屬在入窖發(fā)酵階段處于高豐度但低活性或休眠狀態(tài)[25]。

鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）是一類環(huán)境功能微生物，有一定耐高溫性[26]和較強的代謝糖類并生成有機酸類的能力[27-28]。鞘氨醇單胞菌屬在酒醅3中相對豐度最高，過高的酸度可能是抑制菌株GTY-837產(chǎn)酯并導(dǎo)致酒醅中酯類物質(zhì)含量劇減的主要原因。

芽孢桿菌屬（Bacillus）微生物普遍存在于大曲和堆積酒醅中，是“醬味”的主要貢獻菌屬，在產(chǎn)酶、糖化和生香的過程中扮演著重要的角色[29]，且能代謝產(chǎn)生乙偶姻并通過一系列化學(xué)反應(yīng)最終生成吡嗪類物質(zhì)[30]，酒醅2中四甲基吡嗪含量減少可能是由芽孢桿菌屬豐度降低造成的。

枝芽孢菌屬（Virgibacillus）在酒醅4中相對豐度最高，這是一類嗜鹽微生物且多分布在鹽場，能夠代謝產(chǎn)生植物素[31]；海洋芽孢桿菌屬（Oceanobacillu）分布在珊瑚礁[32]、含鹽土壤[33]和生產(chǎn)設(shè)備表面[34]等環(huán)境中，可以產(chǎn)生多種蛋白酶類[35]。

3 結(jié)論

本研究從醬香型酒醅中篩選得到了一株有較高產(chǎn)酒、生香能力的菌株GTY-837，經(jīng)過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定為東方伊薩酵母菌（Issatchenkia orientalis）；通過耐受性試驗發(fā)現(xiàn)該菌株可以耐受乙醇體積分?jǐn)?shù)10%、乙酸0.5%、乳酸4.0%，并能在40 ℃的高溫下生長，能適應(yīng)醬香型白酒五輪次堆積發(fā)酵環(huán)境；接種菌株GTY-837進行堆積培菌實驗，發(fā)現(xiàn)菌株GTY-837接種量為3%時，酒醅中乙酸乙酯和乳酸乙酯的含量與空白相比分別提高了4 059.45%和70.99%，同時，其他酯類、芳香族和呋喃類物質(zhì)的含量也明顯增加，但TTMP含量降低，分析原因可能是菌株GTY-837抑制了芽孢桿菌屬（Bacillus）的生長所致。當(dāng)菌株GTY-837接種量為5%時，酒醅中高產(chǎn)酸菌屬-鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）的相對豐度明顯提高，這可能是抑制菌株GTY-837代謝產(chǎn)乳酸乙酯和乙酸乙酯的主要原因。綜上，菌株GTY-837具有優(yōu)良的發(fā)酵性能，在堆積培菌過程中能夠顯著提升酒醅中酯類物質(zhì)的種類和含量，在實際生產(chǎn)中是否能達到理想的效果還需進行發(fā)酵驗證。此外，接種菌株GTY-837會減少酒醅的TTMP含量，可考慮同時接種東方伊薩酵母菌和功能性芽孢桿菌以強化堆積培菌過程，實現(xiàn)醬香型酒醅風(fēng)味成分的平衡。