周芳 林濤 代月娥 周勤 蔣蓉

關鍵詞骨癌痛;白藜蘆醇;OPG/RANK/RANK-L信號通路;鎮(zhèn)痛

骨癌痛為乳腺癌、前列腺癌、肺癌等大部分晚期癌癥患者的常見癥狀之一，極大地降低了患者的生活質量[1]。骨癌痛主要表現(xiàn)為痛覺過敏和觸誘發(fā)痛，其中，痛覺過敏是指患者對于刺激性疼痛的敏感程度增強，觸誘發(fā)痛是指非痛刺激（比如壓迫或者冷刺激）引發(fā)的疼痛。目前，臨床上針對骨癌痛的治療方式主要有手術、放療、化療及藥物治療（阿片類鎮(zhèn)痛藥物和雙膦酸鹽類藥物），藥物治療是鎮(zhèn)痛的主要方式;然而由于骨癌痛并非單一的炎性疼痛，且長期使用阿片類藥物具有較大的副作用，使得常規(guī)藥物治療難以達到理想的治療效果[2]。因此，尋找新的治療骨癌痛的藥物十分必要。

白藜蘆醇是一種天然多酚類化合物，具有抗腫瘤、抗炎等藥理作用，且副作用小，耐受性良好[3]。研究表明，膠質細胞功能異?？梢源龠M骨癌痛的中樞敏化[4]，而鞘內注射白藜蘆醇可以有效抑制膠質細胞活化從而緩解骨癌痛[5]。另有研究表明，白藜蘆醇還可通過降低脊髓背角鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ（calmodulin dependentprotein kinase Ⅱ，CaMKⅡ）的活化來抑制骨癌痛發(fā)生時的痛覺過敏[6]。然而，引發(fā)骨癌痛的機制除了神經元活化、膠質細胞功能異常，還有骨組織的破損[7]。骨轉移過程中，成骨細胞/破骨細胞的動態(tài)失衡導致了骨組織的破損，從而引發(fā)疼痛[8]。相關研究發(fā)現(xiàn)，成骨細胞分泌的一系列炎癥因子可增加破骨細胞的活性，進一步加劇骨癌痛[9]。骨保護素（osteoprotegerin，OPG）/核因子κB受體激活因子（receptor activator of NF-κ B，RANK）/RANK 配體（RANK-L）信號通路參與調節(jié)成骨細胞/破骨細胞的動態(tài)平衡和骨癌痛的發(fā)生發(fā)展[10-11]，但是，白藜蘆醇是否可通過這一信號通路來發(fā)揮抗骨癌痛的作用尚未明確。

基于此，本研究采用右后肢脛骨注射乳腺癌Walker256 細胞懸液的方法建立骨癌痛大鼠模型，并以鞘內注射的方式進行給藥，從而研究白藜蘆醇對骨癌痛模型大鼠痛覺、OPG/RANK/RANK-L 信號通路及炎癥因子水平的影響，以期為骨癌痛新藥開發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用儀器主要有37370 型足底熱刺痛儀、NC12775 型VonFrey 纖維絲（上海玉研科學儀器有限公司），311 型二氧化碳培養(yǎng)箱、iBrightTM CL750 型成像儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司），Mini-PROTEAN?Tetra 型垂直電泳槽（美國Bio-Rad 公司），Spectramax M5型多功能酶標儀（美國Molecular Devices公司）。

1.2 主要藥品與試劑

白藜蘆醇購自美國Sigma公司（批號R5010）;RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）均購自美國Thermo FisherScientific 公司（批號分別為A1049101、10099）;兔抗RANK-L 多克隆抗體購自美國Proteintech 公司（批號23408-1-AP）;兔抗RANK多克隆抗體、兔抗OPG多克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔免疫球蛋白G（二抗）、化學發(fā)光試劑盒均購自美國Bio-Rad 公司（批號分別為ab200369、ab183910、1706515、1705061）;兔抗GAPDH多克隆抗體購自美國Merck公司（批號G9545）;磷酸鹽緩沖液（PBS）、胰酶均購自北京索萊寶科技有限公司（批號分別為P1020、T1300）;蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、蛋白上樣緩沖液（5×）、大鼠腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒、大鼠白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）ELISA 試劑盒、大鼠IL-1β ELISA 試劑盒、大鼠趨化因子配體2（chemokine ligand 2，CCL2）ELISA試劑盒均購自上海碧云天生物技術有限公司（批號分別為P0033、P0012、P0286、PT516、PI328、PI303、PC128）;其余試劑為實驗室常用規(guī)格，水為純凈水。

1.3 細胞

大鼠乳腺癌Walker256 細胞（編號ZQ0544）購自上海中喬新舟生物科技有限公司。

1.4 動物

本實驗所用SD 雄性大鼠共40 只，體質量200～220 g，6～8 周齡，均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產許可證號為SCXK（京）2019-0011。所有大鼠隨機分籠飼養(yǎng)，提供充足的食物、飲用水并進行12 h/12 h 的晝夜光照循環(huán)，飼養(yǎng)環(huán)境保證通風、溫度適宜（20～23 ℃）。動物適應環(huán)境2 周后，進行后續(xù)實驗。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

將Walker256 細胞培養(yǎng)于含有10%FBS 的RPMI-1640 培養(yǎng)基中，置于5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞密度達80%時，進行傳代培養(yǎng)。取對數生長期的細胞，用PBS清洗1 遍后，用0.25%胰酶消化1 min，制成單細胞懸液，并用細胞凍存液調整細胞密度為2×107個/mL，用液氮凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 鞘內置管處理

大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）進行麻醉，根據文獻[12]方法操作：使大鼠俯臥于手術布上，以脊髓L6～S1 棘突間隙為中心用碘伏消毒，依次切開皮膚、淺筋膜，分離肌肉暴露出大鼠脊髓L6 的硬脊膜，將PE-10 導管緩慢推入至脊髓L6（插入深度為3 cm），再縫合固定近端導管。術后大鼠分籠飼養(yǎng)，并給予足夠的食物和水。取無運動障礙且髓鞘注射2%利多卡因20 mL后30 s 內出現(xiàn)雙下肢麻痹的大鼠用于實驗。

2.3 造模、分組與給藥

參考文獻[13]方法，建立骨癌痛大鼠模型。將鞘內置管5 d 后且可用于實驗的大鼠，分為假手術組、模型組和白藜蘆醇低、中、高劑量組（0.25、1、2 mg/kg，以二甲基亞砜溶解），每組8 只。除假手術組外，其余各組大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）進行麻醉，使大鼠仰臥于手術臺上，固定右后肢，進行脫毛、碘伏消毒;在大鼠右后肢膝關節(jié)處向下切開約0.5 cm，鈍性分離肌肉，暴露脛骨;用1 mL針頭在脛骨遠端鉆孔，并注入Walker256細胞懸液20 μL（注射完停留1～2 min），再用醫(yī)用膠水迅速封閉針孔，然后逐層縫合。假手術組大鼠暴露脛骨鉆孔后，注射等體積生理鹽水。術后12 d，所有造模大鼠的機械縮足反射閾值和熱縮足反射潛伏期較假手術組大鼠均顯著降低，表明造模成功。造模成功后，白藜蘆醇各劑量組大鼠分別鞘內注射相應藥物，假手術組和模型組大鼠鞘內均注射等體積二甲基亞砜，鞘內注射量為10 μL，每天1次，連續(xù)5 d。

2.4 機械縮足反射閾值的檢測

檢測造模前、造模后（即術后12 d）和給藥后第3、5天各組大鼠的機械縮足反射閾值變化。將大鼠置于底部為金屬網格、四周為透明玻璃的盒子中。待大鼠適應后，用不同彎折力的VonFrey 纖維絲刺激大鼠右后足足底，每次刺激5 s，間隔15 s。當大鼠出現(xiàn)縮足、抬足、舔足等行為時，記錄此時VonFrey 纖維絲對應的折力值（g），即機械縮足反射閾值。整個實驗過程由同一名實驗員進行觸痛刺激，以保持刺激強度一致。每只大鼠重復測量3 次，取平均值。

2.5 熱縮足反射潛伏期的檢測

檢測造模前、造模后（即術后12 d）和給藥后第3、5天各組大鼠的熱縮足反射潛伏期。同樣將大鼠置于底部為金屬網格，四周為透明玻璃的盒子中。待大鼠適應后，用熱刺痛儀刺激大鼠右后足足底。當大鼠出現(xiàn)抬足時，記錄此時熱刺痛儀對應的數值，即熱縮足反射潛伏期。整個實驗過程由同一名實驗員進行熱刺激，以保持刺激強度一致。每只大鼠重復測定3 次（每隔5 min測量1 次），取平均值。

2.6 血清中炎癥因子水平的檢測

采用ELISA法進行檢測。末次給藥后，采集各組大鼠的外周血，置于1.5 mL離心管中，室溫靜置2 h 后，以2 000 r/min 離心10 min，收集血清（上清液）于離心管中。按照ELISA 試劑盒說明書方法分別檢測血清中炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β、CCL2 的水平。

2.7 大鼠脛骨中RANK、RANK-L、OPG蛋白表達水平的檢測

采用Western blot法進行檢測。末次給藥取血后，假手術組、模型組和白藜蘆醇中劑量組大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（300 mg/kg）處死后，迅速取出大鼠的脛骨，置于預冷的生理鹽水中充分浸泡，然后用水清洗3～5 遍。將脛骨組織剪碎，用液氮研磨成粉末。每100 mg骨組織粉末用300 μL RIPA 裂解液混合勻漿，冰浴30 min 后，于4 ℃條件下以12 000 r/min 離心15 min，收集上清液，即為骨組織蛋白。用BCA 試劑盒測量骨組織蛋白的濃度。將骨組織蛋白樣品用loading buffer（5×）稀釋，然后煮沸滅活。待滅活蛋白冷卻至室溫，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉膜并用5%脫脂奶粉封閉90 min，加入RANK、RANK-L、OPG一抗（稀釋度均為1 ∶1 000）和GAPDH一抗（稀釋濃度為1 ∶10 000）孵育過夜;以TBST 漂洗5 min×3 次后，加入二抗（稀釋度為1 ∶10 000）室溫孵育90 min。采用化學發(fā)光試劑盒顯色，并用凝膠成像儀成像，采用Quantity-one 軟件分析蛋白灰度值，以目的蛋白與內參蛋白的灰度值比值表示目的蛋白的表達水平。

2.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0 軟件進行統(tǒng)計分析，數據用x±s 表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

3 結果

3.1 大鼠機械縮足反射閾值的檢測結果

造模前各組大鼠機械縮足反射閾值差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。造模后，與假手術組相比，模型組和白藜蘆醇各劑量組大鼠機械縮足反射閾值均顯著降低（P<0.05）。給藥后第3、5 天，與假手術組相比，模型組大鼠機械縮足反射閾值均顯著降低（P<0.05）;與模型組相比，白藜蘆醇低劑量組大鼠機械縮足反射閾值差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），而白藜蘆醇中、高劑量組大鼠機械縮足反射閾值均顯著升高（P<0.05），且呈劑量依賴趨勢。結果見表1。

3.2 大鼠熱縮足反射潛伏期的檢測結果

造模前各組大鼠熱縮足反射潛伏期差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。造模后，與假手術組相比，模型組和白藜蘆醇各劑量組大鼠熱縮足反射潛伏期均顯著降低（P<0.05）。給藥后第3、5 天，與假手術組相比，模型組大鼠熱縮足反射潛伏期均顯著降低（P<0.05）;與模型組相比，白藜蘆醇低劑量組大鼠熱縮足反射潛伏期差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），而白藜蘆醇中、高劑量組大鼠熱縮足反射潛伏期均顯著升高（P<0.05），且呈劑量依賴趨勢。結果見表2。

3.3 大鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β、CCL2 的水平的檢測結果

與假手術組相比，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β、CCL2 表達水平均顯著升高（P<0.05）。與模型組相比，白藜蘆醇低劑量組大鼠血清中IL-6 水平顯著降低（P<0.05），TNF-α、IL-1β和CCL2 水平差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;白藜蘆醇中、高劑量組大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β、CCL2 水平均顯著降低（P<0.05）。結果見表3。

3.4 大鼠脛骨中RANK、RANK-L、OPG蛋白表達水平的檢測結果

與假手術組相比，模型組大鼠脛骨中RANK、RANK-L蛋白表達水平顯著升高，OPG蛋白表達水平顯著降低（P<0.05）。與模型組相比，白藜蘆醇中劑量組大鼠脛骨中RANK、RANK-L 蛋白表達水平均顯著降低，OPG 蛋白表達水平顯著升高（P<0.05）。結果見圖1、表4。

4 討論

骨癌由多種癌癥的原發(fā)性或繼發(fā)性骨轉移誘發(fā)，約90%的乳腺癌和前列腺癌患者會發(fā)生骨轉移[14]。骨癌發(fā)生發(fā)展過程中會引起劇烈且持續(xù)的疼痛，增加患者死亡率，因此，深入了解骨癌痛的分子機制可為骨癌痛藥物及新作用靶點的開發(fā)提供依據。本研究選用大鼠乳腺癌Walker256 細胞制備骨癌痛大鼠模型，結果發(fā)現(xiàn)，與假手術組相比，模型組大鼠機械縮足反射閾值和熱縮足反射潛伏期均顯著降低，提示骨癌痛模型大鼠出現(xiàn)機械痛敏反應和神經病理性疼痛，表明造模成功。進一步鞘內注射白藜蘆醇發(fā)現(xiàn)，大鼠機械縮足反射閾值和熱縮足反射潛伏期均有所升高。這表明白藜蘆醇可以改善大鼠骨癌痛。

研究發(fā)現(xiàn)，骨腫瘤細胞和相關免疫細胞可釋放大量炎癥因子，如CXCL 家族趨化因子、IL-6、TNF-α和轉化生長因子β（transforming growth factor beta，TGF-β）等，這些炎癥因子可通過致敏外周傷害性感受器或作用于成骨細胞、破骨細胞、神經纖維上的效應器，從而導致骨癌痛的產生[15-16]。研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α和IL-1β是導致骨癌痛的主要促炎因子，可以激活膠質細胞，誘導膠質細胞分泌CCL2，進一步加劇炎癥疼痛[17]。在骨癌痛等慢性疼痛中，機體TNF-α和IL-1β水平升高[18];TNF-α與TNF受體結合[包括TNF-α受體1（TNFR1）和TNF-α受體2（TNFR2）]可導致神經元的敏化[19];IL-1β可以直接增加神經元突觸間興奮傳播，導致機械痛敏反應[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6 和CCL2 的水平均顯著升高，而經白藜蘆醇干預后，大鼠上述炎癥因子水平均降低。這表明白藜蘆醇可以改善大鼠骨癌痛引起的炎癥反應。

在炎癥條件下，OPG/RANK/RANK-L 信號通路調節(jié)的破骨細胞分化會受到影響，從而影響破骨細胞與成骨細胞的動態(tài)平衡[21]。RANK-L 與其受體RANK 結合后可促進破骨細胞的成熟和分化;而OPG是破骨細胞抑制因子，可通過調節(jié)TNF-α、TGF-β、糖皮質激素等的激活，競爭性地抑制RANK與RANKL的結合，從而抑制破骨細胞分化，并促進其凋亡[22]。骨腫瘤中，成骨細胞與破骨細胞的平衡被打破，破骨細胞的增殖及活化可以分泌溶解酶，引發(fā)進行性的溶骨活動，降解骨基質，從而引發(fā)劇烈疼痛[23-24]。一項臨床研究發(fā)現(xiàn)，49 例骨轉移瘤患者外周血中RANK-L 水平遠高于未發(fā)生骨轉移瘤的腫瘤患者，表明RANK-L 可以作為骨轉移瘤的生物標志物[25]。此外，成骨細胞、免疫細胞及腫瘤細胞分泌的炎癥因子可以增加破骨細胞的活性，從而下調OPG，上調RANK-L;同時，活化后的破骨細胞又進一步分泌多種生長因子，促進腫瘤細胞增殖[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠脛骨中OPG蛋白表達水平顯著降低，RANK-L蛋白表達水平顯著升高，提示大鼠脛骨出現(xiàn)了骨吸收和骨破損。由于中劑量的白藜蘆醇已具有鎮(zhèn)痛和緩解炎癥的作用，因此，本研究在后續(xù)Western blot 實驗中僅檢測了白藜蘆醇中劑量組大鼠脛骨中OPG/RANK/RANK-L 信號通路相關蛋白的表達水平。結果發(fā)現(xiàn)，經白藜蘆醇干預后，模型大鼠脛骨中RANK、RANK-L 蛋白表達水平均顯著降低，OPG蛋白表達水平顯著升高。這表明白藜蘆醇可通過抑制OPG/RANK/RANK-L 信號通路活性，抑制破骨細胞活化和骨質破損，從而緩解大鼠骨癌痛。

綜上所述，鞘內注射白藜蘆醇可緩解大鼠骨癌痛引起的炎癥反應，其作用機制可能與抑制OPG/RANK/RANK-L信號通路活性有關。