韋志超，于喆源，楊 博，彭 東

（甘肅省張掖市質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，甘肅 張掖 734000）

食用色素是以改善食品色澤為目的的重要食品添加劑，由于該類添加劑具有色澤鮮艷、著色力強(qiáng)、易于調(diào)色、性質(zhì)穩(wěn)定以及成本低廉等優(yōu)勢(shì)，在食品加工中被廣泛使用[1-3]。食用色素其專業(yè)名稱為食用合成著色劑，是一種非營(yíng)養(yǎng)成分，多以煤焦油中提煉出的苯胺染料為原料研制而成，含有R-N=N-R鍵、苯環(huán)或氧雜蒽等結(jié)構(gòu)[4-7]。為了防止濫用合成著色劑，世界各國(guó)都通過(guò)立法嚴(yán)格控制食物中人工合成著色劑的用量[8-10]。我國(guó)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760—2014）[11]中對(duì)可以作為食品添加劑使用的合成著色劑品種、應(yīng)用范圍以及最高限量均有具體規(guī)定。

茶文化在中國(guó)擁有悠久的歷史和豐富的內(nèi)涵，茶飲料作為一種飲用便捷，同時(shí)兼具傳統(tǒng)茶葉提神解渴功效的飲品，越來(lái)越受到消費(fèi)者的青睞。其含有的茶多酚、黃酮等諸多生理活性物質(zhì)，有抗氧化、抗癌、降低血糖血壓、防治心血管疾病以及抗衰老等多種保健功能[12-13]。市場(chǎng)上部分商人為了追求利益，提高產(chǎn)品的賣相，超范圍在茶飲料中添加合成著色劑，尤其在深受年輕群體歡迎的奶茶類和果茶類飲料更是此類問(wèn)題的頻發(fā)地帶。

目前對(duì)人工合成著色劑的檢測(cè)方法主要采用聚酰胺吸附法[14-15]，利用聚酰胺的化學(xué)性質(zhì)，在酸性環(huán)境下吸附合成著色劑，在堿性環(huán)境下解吸合成著色劑。此純化過(guò)程步驟繁瑣、操作費(fèi)時(shí)，對(duì)于含有大量蛋白質(zhì)、脂肪等成分的奶茶樣品，合成著色劑提取率較低[16]，同時(shí)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)方法采用254 nm波長(zhǎng)檢測(cè)，測(cè)定時(shí)易受樣品基質(zhì)的干擾[17]。QuEChERS作為一種新的前處理方法，具有快速、簡(jiǎn)單、便宜、有效、可靠和安全的特點(diǎn)，其原理是利用吸附劑與基質(zhì)中的雜質(zhì)相互作用，吸附雜質(zhì)從而達(dá)到除雜凈化的目的[18-20]。因此，為了提高茶飲料中人工合成著色劑分析效率，本研究嘗試采用Box-Benhnken 設(shè)計(jì)響應(yīng)面法，采用常見(jiàn)5種合成著色劑平均回收率為表征指標(biāo)，通過(guò)優(yōu)化QuEChERS前處理方法中十八烷基鍵合硅膠（C18）、N-丙基乙二胺（PSA）及提取劑pH[21-23]，確定針對(duì)茶飲料檢測(cè)的最佳方案，以期建立一種經(jīng)濟(jì)高效的茶飲料中合成著色劑的定量分析方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純），成都科??；乙酸（分析純）、乙酸銨（分析純），天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；氨水（分析純），無(wú)水乙醇（分析純），上海國(guó)藥集團(tuán)；檸檬黃、日落黃、胭脂紅、莧菜紅、亮藍(lán)，均為標(biāo)準(zhǔn)品（100 μg/mL），F(xiàn)irst Standard公司；C18、PSA填料，上海麥克林；實(shí)驗(yàn)用水為密理博純水系統(tǒng)（美國(guó)）制得的超純水。

樣品：市售茶飲料。

1.2 儀器與設(shè)備

1290-6460液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國(guó)安捷倫公司；GL323-2SCN型千分之一天平，美國(guó)賽多利斯公司；HN-30AL超聲清洗機(jī)，上海漢諾公司；MV5高通量平行濃縮儀，北京萊伯泰科儀器股份有限公司；Milli-Q型超純水器，美國(guó)Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別吸取上述5種合成著色劑標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL于10 mL容量瓶中，用純水定容至刻度，制成含上述合成著色劑1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品中間液；吸取中間液0.2、0.4、0.8、1.0、2.0、5.0 mL，用超純水定容至10 mL，制成濃度分別為20、40、80、100、200、500 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.2 儀器條件

（1）色譜條件。

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH-C18色譜柱（2.1 mm×10 mm，1.7 μm）；進(jìn)樣量3 μL；柱溫30 ℃；流速0.3 mL/min。流動(dòng)相A為5 mmol/L乙酸銨溶液，B為乙腈，梯度洗脫見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序

（2）質(zhì)譜條件。

電離方式：電噴霧離子源（ESI+）；掃描方式：多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；干燥氣溫度：300 ℃；去溶氣流速：11 L/min；池出口電壓:4 kV；去簇電壓:100 V；碰撞氣：高純氮?dú)猓?9.999%）。5種合成著色劑的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 5種合成著色劑定性、定量離子對(duì)和質(zhì)譜分析參數(shù)

1.3.3 樣品的處理

稱取10 g樣品于50 mL離心管中，加入25 mL無(wú)水乙醇-氨水-水（7∶2∶1），超聲10 min，4000 r/min離心10 min，繼續(xù)添加上述提取劑至40 mL。取上清液10 mL置于另一50 mL離心管中，調(diào)節(jié)pH至中性，加入吸附劑PSA 100 mg和C18 300 mg，渦旋2 min，4000 r/min離心15 min，取10 mL上清液置于蒸發(fā)皿中，蒸至近干，用水定容至2 mL，溶液經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后待用。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

（1）C18用量對(duì)合成著色劑提取率的影響

在PSA添加量為100 mg，pH為7.0的條件下，考察不同C18添加量對(duì)平均回收率的影響。

（2）PSA用量對(duì)合成著色劑提取率的影響

在C18添加量為400 mg，pH為7.0的條件下，考察不同PSA添加量對(duì)平均回收率的影響。

（3）提取液pH對(duì)成著色劑提取率的影響

在PSA添加量為100 mg，C18添加量為400 mg的情況下，考察不同提取劑pH對(duì)平均回收率的影響。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果的分析，選取C18用量、PSA用量、提取液pH三種因素為變量，運(yùn)用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以5種合成著色劑平均回收率為響應(yīng)值，通過(guò)建立響應(yīng)面，試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平

1.3.6 平均回收率的測(cè)定

在空白樣品中分別加入2 mL的1 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，使樣品中的添加量為50 ng/mL。按照“1.3”的方法處理樣品并測(cè)定其每種合成著色劑的含量，并計(jì)算平均回收率。平均回收率公式如下：

式中：Ci為每種合成著色劑的測(cè)量濃度；N為合成著色劑的種類數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果使用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，應(yīng)用Microsoft office Excel 2007與Design Expert 8.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

按“1.3.4 單因素試驗(yàn)”項(xiàng)下要求，按“1.3 方法”項(xiàng)下相關(guān)要求，分別考察不同C18、PSA添加量和提取劑pH對(duì)合成著色劑平均回收率的影響。具體設(shè)計(jì)見(jiàn)表4。

表4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.1.1 C18添加量的確定

按“1.3.4 單因素試驗(yàn)”項(xiàng)下要求，在PSA添加量為100 mg，pH為7.0的條件下，分別按“表4”所示，選取不同C18添加量進(jìn)行提取凈化操作，結(jié)果如圖1所示。

圖1 C18添加量對(duì)合成著色劑平均回收率的影響

由圖1可見(jiàn)，隨著添加C18量的增加，合成著色劑平均回收率也不同，呈現(xiàn)先增大后減小并保持的趨勢(shì)。C18是目前QuEChERS法使用最多的一種吸附劑，對(duì)非極性化合物有較強(qiáng)吸附作用，常被用來(lái)去除極性溶液中的非極性化合物，對(duì)樣品中油脂等雜質(zhì)有較好的吸附效果，可以減少脂溶性雜質(zhì)對(duì)檢測(cè)的干擾。但當(dāng)C18添加量達(dá)到500 mg時(shí)，合成著色劑回收率呈下降趨勢(shì)。因此，在實(shí)際試驗(yàn)中，選取400 mg添加量為C18添加量的中心值。

2.1.2 PSA添加量的確定

按“1.3.4 單因素試驗(yàn)”項(xiàng)下要求，在C18添加量為400 mg，pH為7.0的條件下，分別按“表4”所示，選取不同PSA添加量進(jìn)行提取凈化操作，結(jié)果如圖2所示。

圖2 PSA添加量對(duì)合成著色劑平均回收率的影響

由圖2可見(jiàn)，隨著PSA添加量的增加，合成著色劑平均回收率呈現(xiàn)先上升后保持的趨勢(shì)。PSA通過(guò)氨基的弱離子交換作用和極性基質(zhì)成分形成氫鍵，從而吸附和消除樣品基質(zhì)中的糖類、天然合成著色劑以及脂肪酸。茶飲料中普遍含有糖和天然合成著色劑，通過(guò)添加PSA進(jìn)行吸附可以較好地去除該類雜質(zhì)，當(dāng)用量達(dá)到120 mg時(shí)，合成著色劑平均回收率達(dá)到最高。因此，在實(shí)際試驗(yàn)中，選取120 mg添加量為PSA添加量的中心值。

2.1.3 提取劑pH的確定

按“1.3.4 單因素試驗(yàn)”項(xiàng)下要求，在PSA添加量為100 mg，C18添加量為400 mg的條件下，分別按“表4”所示，選取不同提取劑pH進(jìn)行提取凈化操作，結(jié)果如圖3所示。

圖3 pH對(duì)合成著色劑平均回收率的影響

由圖3可見(jiàn)，待凈化提取液pH對(duì)合成著色劑回收率有較為明顯的影響，在pH為4.0～7.0時(shí)，隨著pH的增加，回收率明顯增加；在pH達(dá)到7.0時(shí)，達(dá)到最大回收率；在pH為7.0～8.0時(shí)，回收率雖然下降，但下降程度較小，但pH在超過(guò)8.0時(shí)，回收率明顯下降，尤其是當(dāng)pH為9.0時(shí)，合成著色劑平均回收率僅為21.7%。根據(jù)各吸附劑性質(zhì)，中性及酸性環(huán)境下，被測(cè)合成著色劑在吸附劑中吸附較弱，隨著提取劑的堿化，合成著色劑呈現(xiàn)解離狀態(tài)，在吸附劑上的吸附增強(qiáng)，平均回收率降低。因此，在實(shí)際試驗(yàn)中，選擇pH等于7.0為中心值。

2.2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果的分析，選取C18用量、PSA用量、提取液pH三種因素為變量，按“1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)”中各個(gè)水平，運(yùn)用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以5種合成著色劑平均回收率為響應(yīng)值，進(jìn)行試驗(yàn)。

采用Design-Expert8.0軟件，按照Box-Behnken組合設(shè)計(jì)[24-26]，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5，并進(jìn)行回歸模型顯著性檢驗(yàn)及方差分析，結(jié)果見(jiàn)表6。

表5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表6 顯著性檢驗(yàn)及方差分析

2.2.1 響應(yīng)曲面分析

采用Design-Expert 8.0軟件對(duì)響應(yīng)值與各因素編碼值進(jìn)行回歸擬合后得到合成著色劑平均回收率與各變量的二次多項(xiàng)式方程模型為：R=0.94+0.014×A+0.031×B+0.38×C-0.035×AB+0.017×AC-0.008×BC-0.044×A2-0.009×B2-0.35×C2。

表6可以看出，方差分析說(shuō)明，該響應(yīng)面分析模型擬合度良好，失擬項(xiàng)P=0.308 3＞0.05不顯著；模型的均方差P<0.000 1，表明回歸模型極顯著；同時(shí)從決定系數(shù)（R2=0.998 7）和校正系數(shù)（R2=0.996 3）得出，選定的因素與響應(yīng)值之間存在較高的相關(guān)性，模型可以用來(lái)解釋和預(yù)測(cè)響應(yīng)值，預(yù)測(cè)值具有較高的可信度；變異系數(shù)CV%=2.85%，表明在該試驗(yàn)條件下，結(jié)果具有較好的穩(wěn)定性和可重復(fù)性；由回歸模型顯著性分析可知：在選取的3種考察因素中，C18添加量和pH對(duì)合成著色劑的平均回收率有非常顯著的影響。

2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析

通過(guò)等高線圖和3D圖可以直觀發(fā)現(xiàn)各因素交互作用對(duì)合成著色劑平均回收率的影響。通過(guò)Design-Expert 8.0軟件中響應(yīng)面優(yōu)化分析方法得出C18添加量、PSA添加量和pH各交互因素對(duì)合成著色劑平均回收率的響應(yīng)面圖和等高線圖，如圖4—6所示。

圖4 C18添加量與PSA添加量交互作用的響應(yīng)面及等高線圖

由圖4中的等高線可知，C18添加量與PSA添加量之間交互關(guān)系呈現(xiàn)為橢圓形，且響應(yīng)值等高線具有較密集的分布；從3D坡度圖看，表現(xiàn)為較為陡峭，表明C18添加量與PSA添加量之間的交互作用對(duì)合成著色劑平均回收率影響較大，與方差分析表中的結(jié)論相符合。圖5、圖6中等高線呈現(xiàn)的橢圓均平行于其中一軸，說(shuō)明影響平均回收率的因素是2個(gè)因素中的其中一項(xiàng)，其交互因素不明顯。具體來(lái)說(shuō)，PSA添加量與pH交互中，pH的大小對(duì)合成著色劑回收率有較為明顯的影響；C18添加量與pH交互中，pH的大小對(duì)合成著色劑回收率有較為明顯的影響。這與表6中得到的結(jié)論相一致。

圖5 PSA添加量與pH交互作用的響應(yīng)面及等高線圖

圖6 C18添加量與pH交互作用的響應(yīng)面及等高線圖

2.2.3 優(yōu)化條件的確定及驗(yàn)證

通過(guò)2.2.1得到的二次多項(xiàng)式方程模型，利用Design-Expert 8.0對(duì)最佳提取條件進(jìn)行預(yù)測(cè)可得，合成著色劑提取條件為C18添加量238 mg、PSA添加量132 mg、pH7.63時(shí)，可達(dá)理論最大回收率99.7%?？紤]實(shí)際實(shí)驗(yàn)情況，提取條件確定為C18添加量250 mg、PSA添加量120 mg、pH為7.5，按以上選定條件按1.3.6中的方法進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表7，得出合成著色劑回收率為（97.7±1.25）%，與預(yù)測(cè)模型結(jié)果相比較，回收率接近，表明該優(yōu)化結(jié)果可靠，用于飲料中合成著色劑提取具有可行性。

表7 驗(yàn)證試驗(yàn)

3 結(jié)論

文章采用響應(yīng)面法，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，最終確定C18添加量、PSA添加量和pH三個(gè)影響因素用于茶飲料中5種合成著色劑的提取，建立的數(shù)學(xué)模型具有良好的顯著性。通過(guò)軟件擬合結(jié)合實(shí)際，確定最佳提取條件為：C18添加量238 mg、PSA添加量132 mg、pH為7.63。結(jié)合實(shí)際情況，提取條件確定為C18添加量250 mg、PSA添加量120 mg、pH為7.5。通過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)，證明該模型擬合情況良好，表明采用響應(yīng)面法優(yōu)化茶飲料中5種合成著色劑提取工藝切實(shí)可行。同時(shí)，該方法操作便捷、高效，且使用試劑少，回收率高。為日常茶飲料市場(chǎng)監(jiān)管提供了一種快速簡(jiǎn)便的方法。