李金鴿，胡丞丞，付培蕾，馮 爽，李 珂，2，李文淵，2*

1.鄭州工業(yè)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，河南 鄭州 450000；2.鄭州工業(yè)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院河南省水環(huán)境與健康工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450000

細菌感染一直是威脅人類生命健康的潛在危險因素，每年都會造成千百萬人感染疾病甚至死亡[1-2]。自1928 年青霉素被發(fā)現(xiàn)并廣泛應(yīng)用于細菌感染治療以來，人類細菌感染性疾病的發(fā)病率和死亡率便大大降低了[3-4]。由于人們對抗生素認知不足和濫用，導(dǎo)致許多細菌產(chǎn)生了耐藥性，致使抗生素的治療功效急劇下降，甚至引發(fā)了一系列不良反應(yīng)。世界衛(wèi)生組織（WHO）已將細菌耐藥性列為一個重要的公共衛(wèi)生問題[3-5]。因此，尋找安全有效、不易產(chǎn)生耐藥性、不良反應(yīng)少的抗菌藥物是當前亟需解決的問題。

中藥常常被用于疾病的控制和預(yù)防，具有來源廣、毒副作用少等特點。中藥抗菌是“后抗生時代”對抗細菌耐藥現(xiàn)象的有效措施。近年來，人們對中藥抗菌的研究日漸增多，魏要武等[6]通過對25 種中藥進行對比研究，發(fā)現(xiàn)丁香、石榴皮、綠茶三種中藥提取物的抗痤瘡功效最明顯。柳香香等[7]研究發(fā)現(xiàn)甘草中的甘草甜素對金黃色葡萄球菌具有明顯的抑制作用，抗菌效果較好。江麗等[8]從金銀花和甘草等20 種中草藥中篩選出了抗菌活性顯著的五味中藥，分別是大黃、黃芩、甘草、牡丹皮和金銀花。進一步的研究表明，中藥主要是通過影響其細胞膜、蛋白質(zhì)及核酸等組分的穩(wěn)定性，來改變其細胞壁的結(jié)構(gòu)和功能，從而達到抑菌效果的。因此，篩選具有抗菌活性的中藥可以為研發(fā)新的抗菌藥物提供理論依據(jù)[9-10]。本實驗選取了21 種中藥提取物分別研究了金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌和大腸桿菌等的抑菌效果，為開發(fā)治療細菌感染性疾病的“中藥抗生素”提供了參考。

1 材料

1.1 材料

金銀花、苦地丁、紅景天、大黃、黃連、黃芩、黃柏、厚樸、決明子、麻黃、丁香、廣藿香、女貞子、綿馬貫眾、板藍根、甘草、大青葉、魚腥草、連翹、桔梗、秦皮，共計21 種，均來自安徽亳州，藥材由鄭州工業(yè)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院李珂副教授鑒定。

1.2 菌種

金黃色葡萄球菌BNCC186335、枯草芽孢桿菌FSCC115037、銅綠假單胞菌GDMCCI443、大腸桿菌ATCC25922 由河南省水環(huán)境與健康工程技術(shù)研究中心天然產(chǎn)物實驗室提供。

1.3 主要儀器

LDZF-75KB-II 立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）、LHS-CL 恒溫恒濕箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、SW-CJ 型超凈工作臺（蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司）、ReadMax1900Plus 光吸收酶標儀（上海閃譜生物科技有限公司）等。

1.4 主要試劑

乙醇、二甲亞砜（DMSO）分別購自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司、天津市富宇精細化工有限公司，本實驗所用到的化學(xué)試劑均為分析純。LB 培養(yǎng)基的成分胰蛋白胨、NaCl、酵母提取物購于北京鴻潤寶順科技有限公司，瓊脂粉購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

2 方法

2.1 中藥提取物的制備

稱取10 g 中藥材粗粉于100 mL 80%乙醇中浸泡30 min，回流提取兩次，時間為70 min，合并濾液。將濾液濃縮至5 mL，放入烘箱中烘干為浸膏。將干燥后的中藥浸膏溶于1 mLDMSO，配制成質(zhì)量濃度為10.24 mg/mL 藥品供試液。

2.2 菌液的制備

將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌分別接種于LB 固體培養(yǎng)基上，置于37 °C 的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h（枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)溫度設(shè)置為28 °C），刮下菌苔，接入10 mL液體培養(yǎng)基，放入搖床培養(yǎng)（150 r/min）。24 h 后，取1 mL 用LB 液體培養(yǎng)基稀釋10 000 倍備用。

2.3 藥材活性的篩選

取無菌96 孔板平底微量培養(yǎng)板，每孔加入10 μL 藥液、90 μL LB 培養(yǎng)基和100 μL 稀釋后的菌液，每相鄰3 孔為1 組平行對照，設(shè)置空白對照組（純菌液），放入35.5 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h，用光吸收酶標儀測量其625 nm 下的吸光度（OD）值，初步記錄初始濃度下提取物的抗菌活性。

2.4 二倍稀釋法測定最小抑菌濃度（MIC）

取無菌96 孔平底微量培養(yǎng)板，在A 行每孔中加入10 μL 中藥提取物母液和190 μLLB 液體培養(yǎng)基，充分混勻。B 至F 行每孔加入100 μLLB 液體培養(yǎng)基，吸取100 μLA 行孔內(nèi)培養(yǎng)液至對應(yīng)的B 行孔，充分混勻；再吸取100 μLB 行孔內(nèi)培養(yǎng)液至對應(yīng)的C 行孔，充分混勻，依次操作，直至F 行。最后各孔均加入100 μL 稀釋后的菌液，混勻。陽性對照組為含1%相應(yīng)抗生素的菌懸液，空白對照組為200 μLLB 液體培養(yǎng)基。將96 孔培養(yǎng)板置于35 °C 恒濕恒溫箱中培養(yǎng)24 h 觀察結(jié)果，用光吸收長酶標儀（625 nm）測定吸光度，計算其MIC 值。

2.5 數(shù)據(jù)處理

3 結(jié)果

3.1 21 種中藥乙醇粗提物體外抗菌活性測定結(jié)果

通過設(shè)置陰性對照與空白對照，分別測試21 種中藥乙醇提取物（初始質(zhì)量濃度10.24 mg/mL 對不同菌種的抑菌活性），結(jié)果如表1 所示。

表1 21 種中藥提取物對不同菌種的抗菌活性測定

3.2 MIC 測定結(jié)果

根據(jù)抗菌活性測定結(jié)果，篩選出具有抗菌活性的中藥提取物，用二倍稀釋法測定其MIC，其結(jié)果見表2-5。金銀花、紅景天、大黃、黃連、黃柏、厚樸、麻黃、丁香、廣藿香、女貞子、綿馬貫眾、板藍根、甘草的乙醇提取物對金黃色葡萄球菌具有顯著的抑制作用，其MIC 值分別為0.84 mg/mL、5.16 mg/mL、2.91 mg/mL、7.01 mg/mL、5.86 mg/mL、1.13 mg/mL、11.42 mg/mL、14.92 mg/mL、12.82 mg/mL、12.97 mg/mL、11.21 mg/mL、4.27 mg/mL、3.62 mg/mL。其他8 種中藥的乙醇提取物對金黃色葡萄球菌無明顯抑制活性。金銀花、黃柏、厚樸、板藍根、甘草、大青葉、桔梗、秦皮對枯草芽孢桿菌的MIC 值分別為11.32 mg/mL、6.51 mg/mL、10.18 mg/mL、11.32 mg/mL、13.01 mg/mL、17.96 mg/mL、6.92 mg/mL、4.27 mg/mL；其他13種中藥的乙醇提取物對枯草芽孢桿菌無明顯抑制抗菌活性。桔梗、秦皮對銅綠假單胞菌的MIC 值均大于20 mg/mL，表明這兩種中藥乙醇提取物對銅綠假單胞菌的抗菌活性較弱，但其他19 種中藥乙醇提取物均無抗菌活性。金銀花、桔梗對大腸桿菌的MIC值分別為8.80 mg/mL、18.69 mg/mL，表明金銀花乙醇提取物對大腸桿菌的抗菌活性比桔梗乙醇提取物好，而其它19 種中藥乙醇提取物均沒有抗菌活性。

表2 13 種中藥提取物對金黃色葡萄球菌的MIC值測定

表3 8 種中藥提取物對枯草芽孢桿菌的MIC 值測定

表4 2 種中藥提取物對銅綠假單胞菌的MIC 值測定

表5 2 種中藥提取物對大腸桿菌的MIC 值測定

4 討論

近年來，人們發(fā)現(xiàn)一些中藥及其活性成分提取物對細菌及病原微生物具有較強的抑制作用。中藥化學(xué)成分復(fù)雜且抑菌機理多樣化，如中藥可以影響微生物細胞膜、蛋白質(zhì)及核酸等組分的穩(wěn)定性，取得抑菌效果。我們應(yīng)發(fā)揮中醫(yī)藥理論的優(yōu)勢特色，利用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)研究中藥的化學(xué)成分及其理化性質(zhì)，闡明中藥的抗菌機制，為耐藥菌藥物的研發(fā)和創(chuàng)制提供思路。

本實驗選取的21 種中草藥乙醇提取物對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌分別表現(xiàn)出了不同程度的抗菌效果。從實驗統(tǒng)計結(jié)果可以看出，金銀花、板藍根、甘草、桔梗的乙醇提取物對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑菌作用均很強；紅景天、大黃、黃柏、厚樸的乙醇提取物對金黃色葡萄球菌也有明顯的抑制作用，秦皮乙醇提取物對枯草芽孢桿菌也有一定的抑制作用。桔梗、秦皮的乙醇提取物對銅綠假單胞菌有抑制作用，金銀花、桔梗乙醇提取物對大腸桿菌也有抑制作用。

研究結(jié)果表明，金銀花對革蘭氏陽性菌和陰性菌均有抑菌效果，金銀花乙醇提取物對革蘭氏陽性菌的MIC 比對革蘭氏陰性菌的MIC 強10 倍左右，提示其對革蘭氏陽性菌和陰性菌的作用機制可能不同。該研究為進一步探究金銀花乙醇提取物的抑菌成分及其作用機制奠定了基礎(chǔ)。