劉 芳，胡鵬程，湯樹(shù)生，李 源，劉 寧，劉鼎闊*

1.鼎正新興生物技術(shù)（天津）有限公司，天津 300383；2.天津市企業(yè)技術(shù)中心，天津 300383；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100091

金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinase，MMPs）是一類需要Zn2+、Ca2+等金屬離子作為輔助因子的蛋白酶的總稱。MMPs 參與細(xì)胞胚胎發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)、炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、寄生蟲(chóng)感染、傷口修復(fù)等多項(xiàng)重要生物學(xué)功能[1-4]。MMPs 和飼料中的金屬離子能夠高度協(xié)同提高蛋白酶活性[5]。因此，越來(lái)越多的研究開(kāi)始關(guān)注MMPs。

生物安全是微生物研究領(lǐng)域的重點(diǎn)。但可能由于MMPs 的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，所以大家對(duì)它的生物安全性研究反而較少。因此，本試驗(yàn)旨在研究MMPs 在飼料添加中的生物安全性，為飼用MMPs 的產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 試驗(yàn)用藥

MMPs：活性80 萬(wàn)IU，由天津市生物飼料添加劑企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供（批號(hào)20230406）。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

8 日齡健康海蘭灰公雛雞120 只，體重60g～65g，天津市薊州區(qū)紅海蛋雞養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.3 儀器設(shè)備

全自動(dòng)生化分析儀（型號(hào)：7020），日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社。

電解質(zhì)分析儀（型號(hào)：XD685），上海迅達(dá)醫(yī)療儀器有限公司。

血球監(jiān)護(hù)儀血細(xì)胞分析儀（型號(hào)：BC-2800Vet），深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司。

組織切片機(jī)（型號(hào)：LEICA RM2025）、組織脫水機(jī)（型號(hào)：LEICA TP1020），德國(guó)Leica 公司。

光學(xué)顯微鏡（型號(hào)：BX50），日本Olympus 公司。

1.4 試劑

血液生化檢測(cè)試劑，日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社。

離子檢測(cè)試劑，上海迅達(dá)醫(yī)療儀器有限公司。

2 方法

2.1 試驗(yàn)動(dòng)物分組與給藥

選取體重為60～65 g 的8 日齡海蘭灰公雛雞120 只，分為4 組，每組30 只；分別按照MMPs 的臨床推薦劑量（1 mg/kg 體重）的1 倍、3 倍、5 倍量分為低、中、高劑量組，另設(shè)空白對(duì)照組。預(yù)備試驗(yàn)8 d，正式試驗(yàn)逐只灌服，1 次/d，共5 d。

2.2 臨床觀察

觀察記錄給藥后雞的精神狀態(tài)、飲食、糞便等，如有異常反應(yīng)，及時(shí)記錄并分析原因。

2.3 采食觀察

試驗(yàn)期間每天稱量各組添加飼料量，測(cè)定日采食量。

2.4 體重觀察

連續(xù)給藥5 d，逐只測(cè)定體重。

2.5 血液學(xué)檢查

連續(xù)給藥5 d 后，分別對(duì)每組進(jìn)行心臟采血，每只雞采集適量血樣（EDTA 抗凝管1 管、促凝劑真空采血管1 管），按表1 檢測(cè)項(xiàng)目測(cè)定該血樣。

表1 血液采集生理生化檢測(cè)項(xiàng)目

2.6 病理觀察

連續(xù)給藥5 d 后，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)對(duì)試驗(yàn)雞進(jìn)行撲殺剖解。

大體病變觀察：包括體表檢查、頸部檢查、胸腔及胸腔臟器檢查、腹腔及腹腔臟器檢查、頭部檢查等。

病理組織學(xué)檢查：每組隨機(jī)篩取5 只試驗(yàn)雞，采集心臟、肝臟、腎臟、脾臟、肺臟，制作切片，進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)檢查。

2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用SPSS19.0 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，采用F 檢驗(yàn)對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行差異顯著性分析，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著，P＞0.05 表示差異不顯著。

3 結(jié)果與分析

3.1 臨床觀察

試驗(yàn)期間，各組試驗(yàn)雞均精神狀態(tài)良好，羽毛光滑，飲水及采食正常，排便正常。

3.2 對(duì)采食量的影響

試驗(yàn)各組的采食量與空白對(duì)照組的采食量差異不顯著（P＞0.05）。

3.3 對(duì)試驗(yàn)組雞體重的影響

空白對(duì)照組與低劑量組、中劑量組增重差異不顯著（P＞0.05），與高劑量組增重差異顯著（P＜0.05）。這表明，MMPs 可能會(huì)引起試驗(yàn)組體重產(chǎn)生一定量的增加。

3.4 血液學(xué)檢查

3.4.1 對(duì)雞生理指標(biāo)的影響

如表2 所示，各組在給藥5 d 后，血液生理指標(biāo)與空白對(duì)照組相比均未呈現(xiàn)顯著性差異，血紅蛋白在組織中作為抗氧化劑和鐵代謝的調(diào)節(jié)因子存在，其含量稍高，有可能與劇烈運(yùn)動(dòng)或缺水有關(guān)，表明體內(nèi)鐵離子含量升高，對(duì)機(jī)體無(wú)害。

表2 MMPs 給藥期間對(duì)雞血液學(xué)常規(guī)指標(biāo)的影響（）

表2 MMPs 給藥期間對(duì)雞血液學(xué)常規(guī)指標(biāo)的影響（）

劑量組N WBC/（109·L-1） RBC/（1012·L-1） HGB/（g·L-1）HCT/（L·L-1）MCV/（fL）空白對(duì)照組15259.8±14.472.32±0.17115.00±10.5032.05±3.44140.77±5.56低劑量組15255.7±9.282.34±0.14116.29±6.0732.87±1.89140.83±5.56中劑量組15 255.96±12.332.36±0.20118.36±8.8432.07±3.54140.91±4.19高劑量組15265.39±8.212.38±0.17118.07±8.1633.63±2.67141.30±4.05注：應(yīng)用軟件分析，*表示與空白對(duì)照組比較P＜0.05，差異顯著。MCH/（pg）50.49±2.21 49.72±2.57 50.07±2.06 49.54±2.28 PLT/（109·L-1）25.13±9.53 23.80±8.18 24.57±9.03 32.78±13.86

3.4.2 對(duì)雞生化指標(biāo)的影響

高劑量組TP、ALB、T.CHO 與空白對(duì)照組相比呈顯著性差異，中劑量組K+、Na+、Cl-與空白對(duì)照組相比呈顯著性差異。給藥組GLU 和TG 指標(biāo)與空白對(duì)照組差異顯著，表示胰腺和肝臟效應(yīng)提高，促進(jìn)血糖形成糖原，加速了對(duì)甘油三酯的分解。

3.5 對(duì)雞臟器的影響

連續(xù)給藥后，每組隨機(jī)剖殺5 只試驗(yàn)雞，各組雞外觀、皮膚、皮下及心、肝、肺、脾、腎臟、腸道、胸腺、法氏囊等器官均未見(jiàn)異常。

給藥期組織學(xué)檢測(cè)結(jié)果：

（1）空白對(duì)照組檢測(cè)結(jié)果

各臟器均未見(jiàn)異常病變[6]。

（2）給藥組檢測(cè)結(jié)果

高、中、低劑量組與空白對(duì)照組相比，心、肝、脾、肺、腎均無(wú)異常。

4 討論與結(jié)論

連續(xù)給藥5 d，各組試驗(yàn)雞的精神狀態(tài)、飲食、增重均未見(jiàn)不良影響；給藥5 d 后，血液檢測(cè)指標(biāo)部分呈無(wú)規(guī)律性變化。僅GLU 和TG 指標(biāo)與空白對(duì)照組差異顯著，但這兩項(xiàng)指標(biāo)值呈下降趨勢(shì)，表示胰腺和肝臟效應(yīng)提高，促進(jìn)血糖形成糖原，加速了對(duì)TG的分解，對(duì)機(jī)體呈現(xiàn)良性影響；雞血液GLU 指標(biāo)均顯著提高。在張寧等[7]的研究中，高糖誘導(dǎo)的大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞基質(zhì)MMPs 蛋白表達(dá)，推測(cè)MMPs 與糖含量具有正相關(guān)關(guān)系。有研究[8]發(fā)現(xiàn)，高甘油三酯血癥病人MMPs 水平高于正常人，說(shuō)明TG與MMPs 含量之間存在相關(guān)關(guān)系。MMPs 在多種疾病的發(fā)病機(jī)制中起到重要作用[9-10]。本研究中，試驗(yàn)雞心、肝、脾、肺、腎的病理切片顯示，MMPs 5 倍推薦劑量對(duì)雞的實(shí)質(zhì)臟器未見(jiàn)明顯影響，推測(cè)MMPs的致病機(jī)理可能與動(dòng)物自身的健康水平相關(guān)。

5 結(jié)論

MMPs 對(duì)雞具有良好的安全性，5 倍推薦劑量?jī)?nèi)進(jìn)行臨床使用，安全無(wú)不良反應(yīng)，且具有一定的促生長(zhǎng)作用，對(duì)肝腎及胰腺功能具有一定程度的有益價(jià)值，可以作為添加到飼料中的一種有益酶制劑。