崔看利,周文婧,郝其睿,黃麗,覃東立,霍堂斌,黃曉麗*

(1.中國水產(chǎn)科學研究院黑龍江水產(chǎn)研究所,黑龍江流域漁業(yè)生態(tài)省野外科學觀測研究站,寒地水域水生生物保護與生態(tài)修復重點實驗室,黑龍江 哈爾濱150070;2.天津農(nóng)學院水產(chǎn)學院 天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室,天津300384;3.沈陽藥科大學制藥工程學院,遼寧 沈陽110016)

微生物是池塘生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分,底泥中的微生物不僅參與養(yǎng)殖系統(tǒng)中有機質、無機鹽等物質的循環(huán)代謝及能量代謝[1],影響?zhàn)B殖動物消化系統(tǒng)微生物菌群結構[2],還可通過自身代謝過程分解轉化污染物[3],池塘的自凈能力在一定程度上取決于底泥中微生物的組成和數(shù)量變化[4-5]。因此,養(yǎng)殖池塘微生物生態(tài)學研究對理解細菌群落與養(yǎng)殖環(huán)境的互作關系及漁業(yè)環(huán)境污染控制具有重要意義。

在養(yǎng)殖池塘水體和底泥中細菌群落結構和多樣性方面,國內(nèi)外學者們已開展大量研究。對羅非魚(Oreochromismossambicus)[6]、團頭魴(Megalobramaamblycephala)[7]、斑點叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)[8]及中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)[9]池塘底泥細菌群落的研究均表明變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)和酸桿菌門(Acidobacteria)相對豐度較高,但其優(yōu)勢菌屬各有不同。底泥中細菌群落受養(yǎng)殖方式、養(yǎng)殖品種、營養(yǎng)鹽、溶解氧、鹽度等環(huán)境因素變化的影響較大[10-11]。邱楚雯等[12]發(fā)現(xiàn)暗紋東方鲀(Takifuguobscurus)的傳統(tǒng)養(yǎng)殖與立體種養(yǎng)2種模式下,池塘水體、底泥及養(yǎng)殖動物腸道的微生物群落結構差異主要由水體酸堿度(pH)及氮、磷含量等環(huán)境因子所導致。同一養(yǎng)殖動物,在不同生產(chǎn)和環(huán)境條件下,其底泥微生物優(yōu)勢菌屬有較大差異。章海鑫等[13]研究表明精養(yǎng)草魚(Ctenopharyngodonidella)池塘底泥優(yōu)勢菌屬以地桿菌屬(Geobacter)、厭氧粘細菌屬(Anaeromyxobacter)、鐵細菌屬(Crenothrix)等為主。而Niu等[14]則發(fā)現(xiàn)厭氧繩菌屬(Anaerolinea)、Romboutsia、鯨桿菌屬(Cetobacterium)、Paeniclostridium,Desulfatiglans為主養(yǎng)草魚池塘底泥中的優(yōu)勢菌屬。王一婷等[15]研究中假單胞菌屬(Pseudomonas)、不動桿菌屬(Acinetobacter)是草魚與黃顙魚(Tachysurusfulvidraco)混養(yǎng)池塘底泥中相對豐度較高的菌屬?？梢?漁業(yè)生產(chǎn)方式導致的環(huán)境因子變化是影響池塘底泥微生物群落結構的關鍵因素。

養(yǎng)殖池塘底泥主要是由過剩餌料、生物排泄物、動植物殘體、懸浮顆粒等沉積而成[16],養(yǎng)殖方式和條件的改變勢必會導致底泥質量的變化。現(xiàn)今,池塘養(yǎng)殖多采用精養(yǎng)或半精養(yǎng)方式,主要的區(qū)別在于養(yǎng)殖密度和餌料來源[17-18],而這兩者正是影響底泥沉積和理化性質的主要因素。目前,關于鯉(Cyprinuscarpio)精養(yǎng)/半精養(yǎng)方式對池塘底泥細菌群落的影響研究還鮮有報道,因此有必要開展相關研究,這對理解底泥微生物與養(yǎng)殖環(huán)境的互作關系及漁業(yè)水體污染控制具有重要意義。

本研究以哈爾濱郊區(qū)典型淡水養(yǎng)殖池塘為研究對象,應用高通量測序技術研究了精養(yǎng)/半精養(yǎng)方式下養(yǎng)殖池塘底泥中細菌群落結構與多樣性,分析了其與水體、底泥理化指標間的相關性,探討了環(huán)境因子變化對細菌群落結構的影響,為深入認識池塘生態(tài)系統(tǒng)微生物作用及微生物生態(tài)功能提供理論及數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

實驗池塘位于黑龍江省哈爾濱市賓縣糖坊鎮(zhèn)(東經(jīng)E:121°23′31.71″、北緯N:31°24′59.06″),塘齡均超過10年,池塘面積均為10畝(6 666.67 m2),泥沙質底質,平均水深1.3～1.5 m。在4月清塘后注水,池塘水源為符合漁業(yè)用水要求的地下水。池塘養(yǎng)殖品種主要為鯉,搭配鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)、鳙(Aristichysnobilis),鯉體長70.3～105.0 mm,體重80.0～106.0 g。精養(yǎng)和半精養(yǎng)池塘投放魚苗量分別為1 200～1 300尾/畝和600～700尾/畝。精養(yǎng)池塘全程投喂魚用膨化配合飼料(通威股份有限公司),同時配備投餌機和增氧機,并定點、定時、定質、定量投喂,日投喂量一般為魚體重的2%～4%,根據(jù)天氣、水溫、魚體大小、攝食強度等進行合理調整。半精養(yǎng)池塘通過施肥培養(yǎng)天然餌料與魚用膨化配合飼料相配合,其他條件和精養(yǎng)池塘保持一致。

1.2 樣品采集與處理

每個池塘設置3個采樣點(半精養(yǎng)池塘為CF1、CF2、CF3,精養(yǎng)池塘為JY1、JY2、JY3),選擇夏季(8月)晴朗天氣進行采樣。采集池塘表層水和底層水,充分混合后注入潔凈的聚乙烯瓶中,按要求進行固定密封后運回實驗室,24 h內(nèi)進行常規(guī)理化指標的測定。利用柱狀沉積物采集器采集0～20 cm池塘表層底泥2 kg,裝入無菌樣品袋中-20 ℃保存,并盡快帶回實驗室保存在-80 ℃冰箱中。

1.3 樣品理化指標分析

1.4 水質污染評價方法

池塘水質評價以GB 3838—2002《地表水環(huán)境質量標準》Ⅲ類標準為評價依據(jù)。評價方法根據(jù)NY/T 396—2000《農(nóng)用水源環(huán)境質量監(jiān)測技術規(guī)范》,采用單項污染指數(shù)和綜合污染指數(shù)對采樣區(qū)域水質環(huán)境質量進行整體評價[24-25]計算公式為:

式(1)

當單項污染指數(shù)>1時,單項污染指數(shù)=
1+5·lg(計算值)

式 (2)

式(3)

式(4)

1.5 底泥樣品DNA提取及測序

采用FastDNATM SPIN Kit for Soil試劑盒提取預處理后的底泥樣品中的總DNA,每個樣本提取2次并混為一管,利用瓊脂糖凝膠電泳純化后測定DNA濃度,并送到北京諾禾致源生物信息科技有限公司進行16S擴增子測序,同時基于Illumina 2500 Hiseq平臺進行高通量測序。

1.6 數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計

2 結果與分析

2.1 水體及底泥理化性質分析

表1 2種養(yǎng)殖方式池塘水體和底泥理化指標分析(平均值±標準誤)Tab.1 Analysis of physicochemical property of water and sediment in two aquaculture modes (Mean±SE)

表2 2種養(yǎng)殖方式池塘水質單因子指數(shù)及綜合污染指數(shù)評價結果Tab.2 The evaluation results of single-factor index and comprehensive pollution index of pond water quality of two aquaculture modes

表3 α-多樣性指數(shù)與底泥的理化性質相關性分析Tab.3 Correlation analysis between a-diversity index and physicochemical property of sediment n=6

2.2 池塘底泥細菌群落多樣性分析

2.2.1 Alpha多樣性分析

平均每個池塘底泥樣品得到56 892條序列,共341 353條。不同樣品獲得的有效序列(Effective Tags)條數(shù)分別為53 739、56 457、50 142、54 313、53 744和32 498(有效序列的平均長度為373 bp)。以97%的一致性對所有樣品的有效序列進行聚類,得到不同樣品實際觀測到的OTUs數(shù)目,分別為2 951、3 820、2 943、3 653、3 760和3 144。精養(yǎng)池塘α-多樣性(Shannon、Simpson、Chao1、ACE、Richness)整體高于半精養(yǎng)池塘,但差異不顯著(P>0.05)(圖1A-E)。由圖1 F中的稀釋曲線可知,隨著測序條數(shù)的增加,OTUs數(shù)量迅速升高并逐漸趨向平緩,表明測序數(shù)據(jù)漸進合理,結果覆蓋度較高,與覆蓋度指數(shù)(均在98%以上)相符。

圖1 α-多樣性分析圖(A～F)Fig.1 Diversity analysis diagram(A-F)

2.2.2 Beta多樣性分析

UPGMA聚類分析(圖2A)顯示精養(yǎng)/半精池塘底泥樣本分別聚為單獨的一簇,表明2種養(yǎng)殖池塘底泥細菌群落結構組成呈現(xiàn)出較好的組間差異性和組內(nèi)相似性,不同處理之間能夠明顯進行區(qū)分。為進一步探討池塘底泥細菌群落組成的差異性,使用PCoA分析解釋了底泥細菌群落總變異的59.1%,其中第一主坐標(PCoA1)和第二主坐標(PCoA2)分別解釋了細菌群落總變異的41.0%和 18.1%(圖2B),這說明不同養(yǎng)殖方式對底泥細菌的群落結構組成產(chǎn)生了明顯影響,但精養(yǎng)與半精養(yǎng)池塘底泥細菌群落組間差異不顯著(r2=0.37,P>0.05)。

圖2 2種養(yǎng)殖池塘底泥細菌群落結構層級聚類(A)和PCoA聚類分析(B)Fig.2 Hierarchical clustering of bacterial community structure in the sediment of two cultured ponds (A) and PCoA clustering analysis(B)

2.3 池塘底泥細菌群落的組成

2.3.1 池塘底泥門水平的菌群分布

2種養(yǎng)殖池塘底泥中門水平的微生物種類相似(圖3A、B),但每個種類的相對豐度存在一定差異,如半精養(yǎng)池塘底泥中優(yōu)勢菌門為變形菌門(Proteobacteria)占45%、綠彎菌門(Chloroflexi)占16%、酸桿菌門(Acidobacteria)占10%和擬桿菌門(Bacteroidetes)占14%,而精養(yǎng)池塘Proteobacteria、Chloroflexi、Acidobacteria和Bacteroidetes菌門的相對豐度分別為40%、18%、8%和16%。半精養(yǎng)池塘底泥中梭桿菌門的相對豐度大于精養(yǎng)池塘。

圖3 池塘底泥在門水平上物種相對豐度(A)和熱圖(B)及屬水平物種相對豐度(C)與細菌群落LEfSe分析(D)Fig.3 Relative species abundance (A) and heat map (B) of pond sediment at the phylum level and relative abundance of species at the genus level (C) and LEfSe analysis of bacterial communities (D)

2.3.2 池塘底泥屬水平的菌群分布

半精養(yǎng)與精養(yǎng)池塘共有優(yōu)勢菌屬(圖3C)為長繩菌屬(Longilinea)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、Subdivision3_genera_incertae_sedis、Bellilinea、Gp7、Lentimicrobium。將所有底泥樣本中的菌群進行線性判別LEfSe分析,篩選在不同養(yǎng)殖方式中存在顯著差異的菌群,并構建差異菌群物種信息樹狀圖(圖3D),其中半精養(yǎng)池塘底泥中差異優(yōu)勢菌屬為鐵礦單胞菌屬(Arenimonas),藤黃色單胞菌屬(Luteimonas);而精養(yǎng)池塘底泥中差異優(yōu)勢菌屬為史密斯氏菌屬(Smithella)、狹義梭菌屬(Clostridium_sensu_stricto)。

2.4 池塘底泥細菌PICRUSt功能預測

由圖4可知,2種養(yǎng)殖方式池塘底泥樣本菌群的主要功能基本一致。精養(yǎng)與半精養(yǎng)池塘底泥樣本細菌基因在一級功能層上共包含細胞過程、遺傳信息處理、代謝、有機系統(tǒng)、人類疾病和環(huán)境信息處理6類生物代謝通路(圖4A)和30類二級功能通路(圖4B),展示出了豐富的功能多樣性。一級功能通路中以代謝(Metabolism)的豐度值最高,二級功能通路中豐度排名前10的分別為能量代謝(Energy metabolism)、復制和修復(Replication and repair)、氨基酸代謝(Amino acid metabolism)、碳水化合物代謝(Carbohydrate metabolism)、膜運輸(Membrane transport)、細胞過程和信號傳導(Cellular processes and signaling)、脂質代謝(Lipid metabolism)、細胞運動(Cell motility)、核苷酸代謝(Nucleotide metabolism)和轉錄(Translation)。

圖4 池塘底泥細菌群落的功能類別(A、B)及差異(C)Fig.4 Functional categories(A、B) and differences of bacterial communities(C) in ponds sediment

精養(yǎng)池塘底泥細菌群落功能在硫辛酸代謝通路(Lipoic acid metabolism)、脂肪細胞因子信號通路(Adipocytokine signaling pathway)、脂類生物合成蛋白質通路(Lipid biosynthesis proteins)及谷氨酸能突觸信號通路(Glutamatergic synapse)的相對豐度顯著(P<0.05)高于半精養(yǎng)池塘。而半精養(yǎng)池塘底泥細菌群落功能在MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)、未知功能(Function unknown)、甘氨酸的生物合成和代謝(Glycan biosynthesis and metabolism)、核糖體的合成(Ribosome biogenesis)、PPRA信號通路(PPRA signaling pathway)的相對豐度顯著高于(P<0.05)精養(yǎng)池塘。

2.5 池塘底泥細菌群落與關鍵環(huán)境因子相關性分析

圖5 精養(yǎng)/半精養(yǎng)池塘底泥細菌群落與環(huán)境因子的PCA分析圖Fig.5 PCA analysis of bacterial communities and environmental factors in the sediment of intensive/semi- intensive ponds

3 討論

在淡水養(yǎng)殖池塘中,擬桿菌門、變形菌門和放線菌門分布最為廣泛[33],本研究中2個池塘排名前5的優(yōu)勢菌門均為變形菌門、綠彎菌門、放線菌門、擬桿菌門和酸桿菌門,這與何夢瑩[34]、肖述文等[35]的研究相似。對上海、武漢、江西等南方地區(qū)[12,36-37]的淡水養(yǎng)殖池塘底泥細菌群落研究表明藍藻門是其重要的優(yōu)勢菌群,其豐度狀況與水體富營養(yǎng)化程度緊密相關。在本研究中,藍藻門菌群不是優(yōu)勢種群,這可能與水體水質、氣候條件等因素有關。值得注意的是,半精養(yǎng)池塘中梭桿菌門相對豐度顯著高于精養(yǎng)池塘。梭桿菌門是魚類腸道內(nèi)容物的優(yōu)勢菌門[1],表明底泥微生物群落組成與養(yǎng)殖動物腸道微生物密切相關。半精養(yǎng)池塘中的酸桿菌門相對豐度也較高,可能是排泄物及有機碎屑大量累積后使酸性物質增加,導致pH降低,為酸桿菌門生長提供了物質條件[38]。黃桿菌屬(Flavobacterium)在2個池塘中均有相關豐度,其出現(xiàn)可能與水體富營養(yǎng)程度有關[8]。

本研究中PICRUSt功能預測表明2種池塘底泥菌群的基因功能主要與新陳代謝類功能有關,包括能量代謝、脂質代謝、碳水化合物代謝、氨基酸代謝、核苷酸代謝等,表明底泥細菌積極參與了池塘生態(tài)系統(tǒng)的生理代謝過程。底泥中細菌群落旺盛的新陳代謝活動對水質凈化具有良好的促進作用[39],精養(yǎng)池塘底泥菌群整體代謝功能基因豐度高于半精養(yǎng)池塘,可能是因為兩者底泥及水體理化性質不同導致的。此外,細胞過程和信號轉導、膜運輸?shù)拳h(huán)境信息處理功能以及轉錄、復制和修復等遺傳信息處理功能在各樣本中也均為優(yōu)勢功能。Qiao等[40]研究表明擬桿菌門與脂肪等代謝有關,許鄭超等[41-42]認為菌群基因功能可維持自身生命活動并調節(jié)菌群所處環(huán)境,而環(huán)境波動會觸發(fā)菌群間的群體感應,維持菌群的相對穩(wěn)定?？梢?底泥細菌群落在養(yǎng)殖環(huán)境調控及養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)維持中扮演了重要角色。

4 結論